Determinazione delle relazioni di auto-compatibilità in Apricot Combinando l'impollinazione manuale, la microscopia e le analisi genetiche
Summary
Presentiamo una metodologia per stabilire i requisiti di impollinazione dell’albicocca(Prunus armeniaca L.) che combinano la determinazione dell’auto-in) della microscopia a fluorescenza con l’identificazione del genotipo S mediante l’analisi PCR.
Abstract
L’autoincompatibilità in Rosaceae è determinata da un Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) che è controllato principalmente dal locus multiallelico S. In albicocca, la determinazione delle relazioni di auto-e inter-compatibilità è sempre più importante, poiché il rilascio di un numero importante di nuove cultivar ha portato all’aumento delle cultivar con requisiti di impollinazione sconosciuti. In questo caso, descriviamo una metodologia che combina la determinazione dell’auto-compatibilità mediante impollinazioni manuali e microscopia con l’identificazione del genotipo S mediantel’analisi PCR. Per la determinazione dell’auto-in)compatibilità, i fiori in fase di palloncino da ogni cultivar sono stati raccolti sul campo, impollinati a mano in laboratorio, fissati e macchiati con blu anilina per l’osservazione del comportamento del tubo di polline sotto la microscopia a fluorescenza. Per l’instaurazione di relazioni di incompatibilità tra le cultivar, il DNA di ogni cultivar è stato estratto da foglie giovani e gli alleli Ssono stati identificati dalla PCR. Questo approccio consente di stabilire gruppi di incompatibilità e di chiarire le relazioni di incompatibilità tra le cultivar, che fornisce una preziosa informazione per scegliere i minacciappropriati adatti nella progettazione di nuovi frutteti e per selezionare i genitori appropriati nei programmi di allevamento.
Introduction
L’autoincompatibilità è una strategia di fioritura delle piante per prevenire l’autoimpollinazione e promuovere l’outcrossing1. In Rosaceae, questo meccanismo è determinato da un Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) che è controllato principalmente dal locus multiallelico S2. Nello stile, il gene RNase codifica il determinante tylar S-s,un RNase3, mentre una proteina F-box, che determina il determinante S-pollen,è codificata dal gene SFB 4. L’interazione di autoincompatibilità avviene attraverso l’inibizione della crescita del tubo di polline lungo lo stile impedendo la fecondazione dell’ovulo5,6.
In albicocca, un rinnovamento varietale ha avuto luogo in tutto il mondo negli ultimi due decenni7,8. Questa introduzione di un numero importante di nuove cultivar, provenienti da diversi programmi di allevamento pubblico e privato, ha portato all’aumento delle cultivar di albicocche con requisiti di impollinazione sconosciuti8.
Diverse metodologie sono state utilizzate per determinare i requisiti di impollinazione nell’albicocca. Nel campo, l’auto-(in)compatibilità può essere stabilita da impollinazioni controllate in alberi in gabbia o in fiori evirati e successivamente registrando la percentuale di set di frutta9,10,11,12. Inoltre, in laboratorio sono state effettuate impollinazioni controllate dalla cultura semi-in vivo dei fiori e dall’analisi del comportamento del tubo di polline sotto microscopia a fluorescenza8,13,14,15,16,17. Recentemente, le tecniche molecolari, come l’analisi pcR e il sequenziamento, hanno permesso la caratterizzazione delle relazioni di incompatibilità basate sullo studio dei geni RNase e SFB 18,19. In albicocca, 33 S-alleli sono stati segnalati (S1 a S20, S22 a S30, S52, S53, Sv, Sx), tra cui un allele correlato con autocompatibilità (S)12,18,20,21,22,23,24. Finora, 26 gruppi di incompatibilità sono stati accoltellati in questa specie secondo la S-genotipo8,9,17,25,26,27. S Le cultivar con gli stessi S-allelisono intercompatibili, mentre le cultivar con almeno un allele Adiverso e, di conseguenza, assegnate in diversi gruppi incompatibili, sono intercompatibili.
Per definire i requisiti di impollinazione delle cultivar di albicocca, descriviamo una metodologia che combina la determinazione dell’auto-in)compatibilità mediante microscopia a fluorescenza con l’identificazione del genotipo S-mediante l’analisi PCR nelle cultivar di albicocca. Questo approccio consente di stabilire gruppi di incompatibilità e chiarire le relazioni di incompatibilità tra le cultivar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tradizionalmente, la maggior parte delle cultivar europee di albicocche commerciali erano auto-compatibili36. Tuttavia, l’uso di cultivar auto-incompatibili nordamericane come genitori nei programmi di allevamento negli ultimi decenni ha portato al rilascio di un numero crescente di nuove cultivar auto-incompatibili con requisiti di impollinazione sconosciuti7,8,37. Pertanto, la determinazione delle relaz…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata dal ministro de Ciencia, Innovaciàn y Universidades-European Regional Development Fund, European Union (AGL2016-77267-R e AGL2015-74071-JIN); Instituto Nacional de Investigaciàn y Tecnolog à Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragàn-European Social Fund, European Union (Grupo Consolidado A12_17R), Fundaciàn Biodiversidad e Agroseguro S.A.
Materials
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8010.22 | |
| BIOTAQ DNA Polymerase kit | Bioline | BIO-21060 | |
| Bright field microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| CEQ System Software | Beckman Coulter | ||
| DNeasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 69106 | |
| dNTP Set, 4 x 25 µmol | Bioline | BIO-39025 | |
| GenomeLab DNA Size Standard Kit – 400 | Beckman Coulter | 608098 | |
| GenomeLab GeXP Genetic Analysis System | Beckman Coulter | ||
| GenomeLab Separation Buffer | Beckman Coulter | 608012 | |
| GenomeLab Separation Gel LPA-1 | Beckman Coulter | 391438 | |
| HyperLadder 100bp | Bioline | BIO-33029 | |
| HyperLadder 1kb | Bioline | BIO-33025 | |
| Image Analysis System | Leica Microsystems | ||
| Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system | Bio-Rad | 170-8640 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| pH-Meter BASIC 20 | Crison | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Power Pack P 25 T | Biometra | ||
| Primer Forward | Isogen Life Science | ||
| Primer Reverse | Isogen Life Science | ||
| Quantity One Software | Bio-Rad | ||
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | MZ-16 | |
| Sub-Cell GT | Bio-Rad | ||
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Taq DNA Polymerase | QIAGEN | 201203 | |
| Vertical Stand Autoclave | JP Selecta |
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