JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie du développement

Определение отношений к само- и межповреждению в сочетании с абрикосом, комбинируя опыление рук, микроскопию и генетический анализ

Published: June 16, 2020
doi:
10.3791/60241
, , ,
1Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza), 3Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea La Mayora (IHSM La Mayora-UMA-CSIC)

Summary

Представляем методологию определения требований к опылинию сортов абрикоса(Prunus armeniaca L.), сочетающих определение самостоятельной (в) совместимости флуоресценции микроскопией с идентификацией S-генотипа с помощью анализа ПЦР.

Abstract

Самосовместимость в розацеи определяется гаметофитической системой самосовместимости (GSI), которая в основном контролируется мультиаллеловым локусом S. В абрикосе определение отношений между собой и между собой приобретает все большее значение, поскольку высвобождение значительного числа новых сортов привело к увеличению сортов с неизвестными требованиями к опылению. Здесь мы описываем методологию, которая сочетает в себе определение самостоятельности (в) совместимости путем S-ручных опыления и микроскопии с определением S-генотипа путем анализа ПЦР. Для самостоятельного (в) определение совместимости, цветы на воздушном шаре этапе от каждого сорта были собраны в поле, ручной опыляется в лаборатории, фиксированной, и окрашенные с анилиновым синим для наблюдения поведения трубки пыльцы под флуоресценции микроскопии. Для установления несовместимости отношений между сортами, ДНК из каждого сорта Sбыла извлечена из молодых листьев и S-аллели были определены ПЦР. Такой подход позволяет создавать группы несовместимости и выясывать несовместимость отношений между сортами, что дает ценную информацию для выбора подходящих опылителей при проектировании новых садов и выбора соответствующих родителей в программах разведения.

Introduction

Самосовместимость является стратегия цветения растений для предотвращения самоопыления и содействия outcrossing1. В Rosaceae этот механизм определяется гаметофитической системой самосовместимости (GSI), которая в основном контролируется многоаллюровым локусом S2. В стиле, ген RNase кодирует S-stylar determinant, RNase3, в то время как белок F-box, который определяет S-пыльцудетерминант, кодифицирован геном SFB 4. Взаимодействие с автосмешазнанием происходит через ингибирование роста пыльцевой трубки по стилю, предотвращающее оплодотворение яйцеклетки5,,6.

В абрикосе, разнообразие обновления состоялась во всем мире в последние два десятилетия7,8. Это введение значительного количества новых сортов, из различных государственных и частных программ разведения, привело к увеличению сортов абрикоса с неизвестными требованиями опыления8.

Различные методологии были использованы для определения требований опыления в абрикосе. В поле, самостоятельной (в) совместимость может быть установлена контролируемых опыляний в клетке деревьев или в выхолощенных цветов, а затем записи процент фруктов набор9,10,11,12. Кроме того, в лаборатории были проведены контролируемые опыления полуинфицейной культурой цветов и анализ поведения пыльцы трубки под флуоресценцией микроскопии8,,13,,14,,15,,16,17. В последнее время молекулярные методы, такие как анализ пЦР и секвенирование, позволили характеристику несовместимости отношений на основе изучения генов RNase и SFB 18,19. В абрикосе, тридцать три S-аллелей были зарегистрированы (S1 до S20, S22 до S30, S52, S53, SV, Sх), в том числе один аллель, связанные с само совместимости (Sc)12,18,20,21,22,23,24. До сих пор, 26 групп несовместимости были стабилизированных в этом виде в соответствии сS-генотип8,9,17,25,26,27. Сорта с теми Sже S-аллелями несовместимы, в то время как сорта с по крайней мере с одним разным S-аллельом и, следовательно, распределенные в разных несовместимых группах, являются взаимосвязанными. S

Для определения требований к опыления абрикосовых сортов мы описываем методологию, которая сочетает в себе определение самостоятельной (в) совместимости флуоресценции микроскопии с определением S-генотипапутем анализа ПЦР в абрикосовых сортах. Такой подход позволяет создавать группы несовместимости и выяснение взаимосвязей между сортами.

Protocol

1. Определение самоуправства (в)совместимости Попробуйте цветы в поле. Необходимо собрать цветы на воздушном шаре этапе(рисунок 1А), соответствующие стадии 58 по шкале BBCH для абрикоса28, чтобы избежать нежелательных предыдущих опыления. <str…

Representative Results

Исследования опыления в абрикосе требуют использования цветов на поздней стадии воздушного шара за день до антеза(Рисунок 1А). Эта стадия считается наиболее благоприятной как для пыльцы, так и для коллекции пистилов, так как цветочные структуры почти зрелые, но…

Discussion

Традиционно, большинство коммерческих абрикосовых европейских сортов были совместимы36. Тем не менее, использование североамериканских самоухотных сортов в качестве родителей в программах разведения в последние десятилетия привело к выпуску все большего числа новых нес…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование финансировалось Ministerio de Ciencia, Innovaci’n y Universidades-Европейский фонд регионального развития, Европейский союз (AGL2016-77267-R, и AGL2015-74071-JIN); Национальный институт Инвестигазон-и-Текнология Агрария и Алиментария (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-00); Европейский социальный фонд Гобьерно-де-Арагон, Европейский союз (A12_17R A12_17R, Фонд Биодиверсидад и Агросегуро С.А.

Materials

Agarose D1 Low EEO Conda 8010.22
BIOTAQ DNA Polymerase kit Bioline BIO-21060
Bright field microscope Leica Microsystems DM2500
CEQ System Software Beckman Coulter
DNeasy Plant Mini Kit QIAGEN 69106
dNTP Set, 4 x 25 µmol Bioline BIO-39025
GenomeLab DNA Size Standard Kit – 400 Beckman Coulter 608098
GenomeLab GeXP Genetic Analysis System Beckman Coulter
GenomeLab Separation Buffer Beckman Coulter 608012
GenomeLab Separation Gel LPA-1 Beckman Coulter 391438
HyperLadder 100bp Bioline BIO-33029
HyperLadder 1kb Bioline BIO-33025
Image Analysis System Leica Microsystems
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 system  Bio-Rad 170-8640
NanoDrop One Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 13-400-518
pH-Meter BASIC 20 Crison
Phusion High-Fidelity PCR Kit Thermo Fisher Scientific F553S
Power Pack P 25 T Biometra
Primer Forward Isogen Life Science
Primer Reverse Isogen Life Science
Quantity One Software Bio-Rad
Stereoscopic microscope Leica Microsystems MZ-16
Sub-Cell GT Bio-Rad
SYBR Safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
Taq DNA Polymerase QIAGEN 201203
Vertical Stand Autoclave JP Selecta
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Silva, N. F., Goring, D. R. Mechanisms of self-incompatibility in flowering plants. Cellular and Molecular Life Sciences. 58, 1988-2007 (2001).
  2. Charlesworth, D., Vekemans, X., Castric, V., Glémin, S. Plant self-incompatibility systems: A molecular evolutionary perspective. New phytologist. 168, 61-69 (2005).
  3. Tao, R., et al. Identification of stylar RNases associated with gametophytic self-incompatibility in almond (Prunus dulcis). Plant and Cell Physiology. 38, 304-311 (1997).
  4. Ushijima, K., et al. Structural and transcriptional analysis of the self-incompatibility locus of almond: Identification of a pollen-expressed F-box gene with haplotype-specific polymorphism. The Plant cell. 15, 771-781 (2003).
  5. Bedinger, P. A., Broz, A. K., Tovar-Mendez, A., McClure, B. Pollen-Pistil Interactions and Their Role in Mate Selection. Plant Physiology. 173, 79-90 (2017).
  6. Guerra, M. E., Rodrigo, J. Japanese plum pollination: A review. Scientia Horticulturae. 197, 674-686 (2015).
  7. Zhebentyayeva, T., Ledbetter, C., Burgos, L., Llacer, G., Badenes, M. L., Byrne, D. Apricot. Fruit Breeding. , 415-458 (2012).
  8. Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing Production in the New Generation of Apricot Cultivars: Self-incompatibility, S-RNase Allele Identification, and Incompatibility Group Assignment. Frontiers in Plant Science. 9, 527 (2018).
  9. Egea, J., Burgos, L. Detecting Cross-incompatibility of Three North American Apricot Cultivars and Establishing the First Incompatibility Group in Apricot. Journal of the American Society for Horticultural Science. 121, 1002-1005 (1996).
  10. Rodrigo, J., Herrero, M. Effects of pre-blossom temperatures on flower development and fruit set in apricot. Scientia Horticulturae. 92, 125-135 (2002).
  11. Julian, C., Herrero, M., Rodrigo, J. Flower bud differentiation and development in fruiting and non-fruiting shoots in relation to fruit set in apricot (Prunus armeniaca). Trees. 24, 833-841 (2010).
  12. Muñoz-Sanz, J. V., Zuriaga, E., López, I., Badenes, M. L., Romero, C. Self-(in)compatibility in apricot germplasm is controlled by two major loci, S and M. BMC Plant Biology. 17, 82 (2017).
  13. Burgos, L., Berenguer, T., Egea, J. Self- and Cross-compatibility among Apricot Cultivars. HortScience. 28, 148-150 (1993).
  14. Rodrigo, J., Herrero, M. Evaluation of pollination as the cause of erratic fruit set in apricot “Moniqui”. Journal of Horticultural Science. 71, 801-805 (1996).
  15. Milatović, D., Nikolić, D., Krška, B. Testing of self-(in)compatibility in apricot cultivars from European breeding programmes. Horticultural Science. 40 (2), 65-71 (2013).
  16. Milatović, D., Nikolić, D., Fotirić-Aksić, M., Radović, A. Testing of self-(in)compatibility in apricot cultivars using fluorescence microscopy. Acta Scientiarum Polonorum, Hortorum Cultus. 12 (6), 103-113 (2013).
  17. Herrera, S., Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Lora, J. Identification of Self-Incompatibility Alleles by Specific PCR Analysis and S-RNase Sequencing in Apricot. Int J Mol Sci. 19, 3612 (2018).
  18. Romero, C., et al. Analysis of the S-locus structure in Prunus armeniaca L. Identification of S-haplotype specific S-RNase and F-box genes. Plant Molecular Biology. 56, 145-157 (2004).
  19. Halász, J., Pedryc, A., Hegedus, A. Origin and dissemination of the pollen-part mutated SC haplotype which confers self-compatibility in apricot (Prunus armeniaca). New Phytologist. 176, 792-803 (2007).
  20. Halász, J., Hegedus, A., Hermán, R., Stefanovits-Bányai, &. #. 2. 0. 1. ;., Pedryc, A. New self-incompatibility alleles in apricot (Prunus armeniaca L.) revealed by stylar ribonuclease assay and S-PCR analysis. Euphytica. 145, 57-66 (2005).
  21. Vilanova, S., Romero, C., Llacer, G., Badenes, M. L., Burgos, L. Identification of Self-(in)compatibility Alleles in Apricot by PCR and Sequence Analysis. Journal of the American Society for Horticultural Science. 130, 893-898 (2005).
  22. Feng, J., et al. Detection and transcript expression of S-RNase gene associated with self-incompatibility in apricot (Prunus armeniaca L.). Molecular Biology Reports. 33, 215-221 (2006).
  23. Zhang, L., et al. Identification of self-incompatibility (S-) genotypes of Chinese apricot cultivars. Euphytica. 160, 241-248 (2008).
  24. Wu, J., et al. Identification of S-haplotype-specific S-RNase and SFB alleles in native Chinese apricot (Prunus armeniaca L). Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 84, 645-652 (2009).
  25. Szabó, Z., Nyéki, J. Blossoming, fructification and combination of apricot varieties. Acta Horticulturae. 293, 295-302 (1991).
  26. Halász, J., Pedryc, A., Ercisli, S., Yilmaz, K. U., Hegedűs, A. S-genotyping supports the genetic relationships between Turkish and Hungarian apricot germplasm. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135, 410-417 (2010).
  27. Lachkar, A., et al. Identification of self-(in)compatibility S-alleles and new cross-incompatibility groups in Tunisian apricot (Prunus armeniaca L.) cultivars. The Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 88, 497-501 (2013).
  28. Pérez-Pastor, A., Ruiz-Sánchez, M. C., Domingo, R., Torrecillas, A. Growth and phenological stages of Búlida apricot trees in South-East. Agronomie. 24, 93-100 (2004).
  29. Williams, J. H., Friedman, W. E., Arnold, M. L. Developmental selection within the angiosperm style: using gamete DNA to visualize interspecific pollen competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 9201-9206 (1999).
  30. Julian, C., Herrero, M., Rodrigo, J. Anther meiosis time is related to winter cold temperatures in apricot (Prunus armeniaca L.). Environmental and Experimental Botany. 100, 20-25 (2014).
  31. Guerra, M. E., López-Corrales, M., Wünsch, A., Rodrigo, J. Lack of Fruit Set Caused by Ovule Degeneration in Japanese Plum. Journal of the American Society for Horticultural Science. 136 (6), 375-381 (2011).
  32. Guerra, M. E., Wünsch, A., López-Corrales, M., Rodrigo, J. Flower Emasculation as the Cause for Lack of Fruit Set in Japanese Plum Crosses. Journal of the American Society for Horticultural Science. 135 (6), 556-562 (2010).
  33. Hormaza, J. I., Pinney, K., Polito, V. S. Correlation in the tolerance to ozone between sporophytes and male gametophytes of several fruit and nut tree species (Rosaceae). Sexual Plant Reproduction. 9, 44-48 (1996).
  34. Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Pistil Starch Reserves at Anthesis Correlate with Final Flower Fate in Avocado (Persea americana). PLOS ONE. 8 (10), 78467 (2013).
  35. Tao, R., et al. Molecular typing of S-alleles through Identification, Characterization and cDNA cloning for S-RNases in Sweet Cherry. Journal of the American Society for Horticultural Science. 124, 224-233 (1999).
  36. Burgos, L., et al. The self-compatibility trait of the main apricot cultivars and new selections from breeding programmes. Journal of Horticultural Science. 72, 147-154 (1997).
  37. Hormaza, J. I., Yamane, H., Rodrigo, J., Kole, C. Apricot. Genome Mapping and Molecular Breeding in Plants, Volume 4 Fruits and Nuts. , 171-187 (2007).
  38. Benmoussa, H., Ghrab, M., Ben Mimoun, M., Luedeling, E. Chilling and heat requirements for local and foreign almond (Prunus dulcis Mill.) cultivars in a warm Mediterranean location based on 30 years of phenology records. Agricultural and Forest Meteorology. 239, 34-46 (2017).
  39. Rodrigo, J., Herrero, M., Hormaza, J. I. Pistil traits and flower fate in apricot (Prunus armeniaca). Annals of Applied Biology. 154, 365-375 (2009).
  40. Williams, R. R., Williams, R. R., Wilson, D. Techniques used in fruit-set experiments. Towards Regulated Cropping. , 57-61 (1970).
  41. Sutherland, B. G., Robbins, T. P., Tobutt, K. R. Primers amplifying a range of Prunus S-alleles. Plant Breeding. 123, 582-584 (2004).
  42. Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research. 8, 4321-4325 (1980).
  43. Porebski, S., Bailey, L. G., Baum, B. R. Modification of a CTAB DNA Extraction Protocol for Plants Containing High Polysaccharide and Polyphenol Components. Plant Molecular Biology Reporter. 15 (1), 8-15 (1997).
  44. Rogers, S. O., Bendich, A. J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Molecular Biology. 5 (2), 69-76 (1985).
  45. Hormaza, J. I. Molecular characterization and similarity relationships among apricot (Prunus armeniaca L.) genotypes using simple sequence repeats. Theoretical and Applied Genetics. 104, 321-328 (2002).
  46. Sonneveld, T., Tobutt, K. R., Robbins, T. P. Allele-specific PCR detection of sweet cherry self-incompatibility (S) alleles S1 to S16 using consensus and allele-specific primers. Theoretical and Applied Genetics. 107, 1059-1070 (2003).
  47. Hegedus, A., Lénárt, J., Halász, J. Sexual incompatibility in Rosaceae fruit tree species: molecular interactions and evolutionary dynamics. Biologia Plantarum. 56 (2), 201-209 (2012).
  48. Fernández i Martí, A., Gradziel, T. M., Socias i Company, R. Methylation of the Sf locus in almond is associated with S-RNase loss of function. Plant Molecular Biology. 86, 681-689 (2014).
  49. Company, R. S. i., Kodad, O., Martí, A. F. i., Alonso, J. M. Mutations conferring self-compatibility in Prunus species: From deletions and insertions to epigenetic alterations. Scientia Horticulturae. 192, 125-131 (2015).
  50. Boskovic, R., Tobutt, K. R. Correlation of stylar ribonuclease zymograms with incompatibility alleles in sweet cherry. Euphytica. 90, 245-250 (1996).
  51. Cachi, A. M., Wünsch, A. S-genotyping of sweet cherry varieties from Spain and S-locus diversity in Europe. Euphytica. 197 (2), 229-236 (2014).
  52. Zuriaga, E., et al. An S-locus Independent Pollen Factor Confers Self-Compatibility in “Katy” Apricot. PLoS ONE. 8 (1), 53947 (2013).

Tags

Self-compatibilityInter-compatibilityIncompatibilityApricotHand-pollinationMicroscopyGenetic AnalysisPollination RequirementsCultivar IdentificationIncompatibility GroupsSelf-incompatibilityFruit Tree CropsCherryPlumBBCH ScaleEmasculationPollen GerminationMicroscopyFixative SolutionEthanolPollen Germination MediumSodium SulfiteAutoclaving
check_url/fr/60241?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of Self- and Inter-(in)compatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses. J. Vis. Exp. (160), e60241, doi:10.3791/60241 (2020).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image