בדיקה ביומכנית של הגידים של מורנה
Summary
הפרוטוקול מתאר יעיל ומלא מתיחה שיטות בדיקה ביומכנית עבור הגידים murine באמצעות שימוש מותאם אישית התאמה תלת-ממד גופי מודפס.
Abstract
הפרעות גיד נפוצות, להשפיע על אנשים בכל הגילאים, והם לעתים קרובות מתישה. טיפולים סטנדרטיים, כגון תרופות אנטי דלקתיות, שיקום, ותיקון כירורגי, לעתים קרובות להיכשל. כדי להגדיר תפקוד גיד ולהפגין יעילות של טיפולים חדשים, התכונות המכאניות של הגידים מדגמי בעלי חיים חייבים להיקבע במדויק. מודלים בעלי חיים מוריין נמצאים כעת בשימוש נרחב כדי ללמוד הפרעות גיד ולהעריך טיפולים חדשניים עבור tendinopathies; עם זאת, קביעת תכונות מכניות של גידים העכבר כבר מאתגרת. במחקר זה, מערכת חדשה פותחה עבור בדיקות גיד מכני הכולל 3D-מודפס גופי כי בדיוק להתאים את האנטוניות של הזרוע ואת calcaneus לבדיקה מכנית הגידים הגיד וגידים אכילס, בהתאמה. מתקנים אלה פותחו באמצעות 3D שחזורים של אנטומיה העצם יליד, מידול מוצק, וייצור מוספים. הגישה החדשה חיסלה כישלונות מרתק העובדתית (למשל, כישלון בצלחת הצמיחה כישלון ולא בגיד), ירד זמן הבדיקה הכוללת, והגדילה הגוברת. יתרה מזאת, שיטה חדשה זו ניתנת להתאמה בקלות לבדיקת גידים מורקיים וגידים מבעלי חיים אחרים.
Introduction
הפרעות גיד נפוצות מאוד נפוץ בקרב אוכלוסיות הזדקנות, אתלטי, פעיל1,2,3. בארצות הברית, 16,400,000 פציעות של רקמת חיבור מדווחות בכל שנה4 וחשבון עבור 30% מכל הביקורים הקשורים במשרד הרופא3,5,6,7, שמונה. האתרים המושפעים ביותר הנפוצים כוללים את מסובבי השרוול, גיד אכילס, וגיד הפצ’יני9. למרות מגוון של טיפולים שאינם אופרטיביים ואופרטיביים, כולל תרופות אנטי דלקתיות, שיקום, תיקון כירורגי, התוצאות להישאר עניים, עם תשואה מוגבלת לתפקד ושיעור גבוה של כישלון5, . שישה מטרים התוצאות הקליניות המסכנות הללו מונעים מחקרים בסיסיים וטרנסלבותית המבקשים להבין את הטדינפתיה ולפתח גישות לטיפול הרומן.
מאפיינים ביומכתיים מתיחה הם התוצאות העיקריות כמותית הגדרת תפקוד גיד. לפיכך, אפיון מעבדה של מטנופתיה ויעילות הטיפול חייב לכלול בדיקות קפדניות של תכונות מתיחה גיד. מחקרים רבים תיארו שיטות לקביעת התכונות הביומכאניות של הגידים מדגמי בעלי חיים כגון חולדות, כבשים, כלבים וארנבים10,11,12. עם זאת, מחקרים מעטים בדקו את התכונות הביומכאניות של גידים murine, בעיקר בשל הקשיים באחיזת רקמות קטנות עבור בדיקות מתיחה. כמו מודלים מורקיים יש יתרונות רבים עבור מכניזציה ללמוד tendinopathy, כולל מניפולציה גנטית, אפשרויות מגיב נרחב, ועלות נמוכה, פיתוח של שיטות מדויקות ויעילים כדי מבחן ביוזול רקמות murine נדרש.
כדי לבדוק כראוי את התכונות המכאניות של הגידים, את הרקמה יש לתפוס ביעילות, מבלי לחמוק או לקרוע העובדתי על ממשק אחיזה או שבירה של צלחת הצמיחה. במקרים רבים, במיוחד עבור גידים קצרים, העצם היא אחזה בקצה אחד ואת הגיד הוא תפס בצד השני. עצמות מאובטחים בדרך כלל על ידי הטבעת אותם בחומרים כגון אפוקסי שרף13 ו פולימתילמתיונין14,15. הגידים מוצבים לעתים קרובות בין שתי שכבות של נייר זכוכית, מודבק עם ציאנואקריאקרילי, ומאובטח באמצעות התפסים דחיסה (אם חתך הצלב הוא שטוח) או במדיום קפוא (אם חתך הרוחב גדול)15,16,17 . שיטות אלה הוחלו על גידים מורחיים בבחינה ביוחנונית, אבל האתגרים נובעים בשל הגודל הקטן של הדגימות ואת הציות של צלחת הצמיחה, אשר מעולם לא להתקשות18. לדוגמה, קוטרו של ראש מפרק murine הוא רק כמה מילימטרים, ובכך עושה מרתק של העצם קשה. במיוחד, בדיקות מתיחה של מורטין הרום קוצי גיד אל עצם דגימות לעתים קרובות התוצאות כישלון בצלחת הצמיחה ולא בגיד או בתזה הגיד. באופן דומה, בדיקה ביומכנית של גיד אכילס הוא מאתגר. למרות גיד אכילס גדול יותר מאשר גידים מורקיים אחרים, calcaneus הוא קטן, עושה מרתק זה קשה העצם. העצם ניתן להסיר, ואחריו לרתק את שני גיד הקצוות; עם זאת, זה מונע את הבדיקה של ההחזקה גיד לעצם. קבוצות אחרות הדו ח מרתק את העצם calcaneus באמצעות מותאם אישית ואביזרים19,20, עיגון על ידי מלחציים21, תיקון עצמית מרפא בטון פלסטיק22 או באמצעות חריץ בצורת חרוט22, עדיין אלה שיטות קודמות נשארות מוגבלות על ידי שיעור מעבר נמוך, שיעורי כשל גבוהים מפתים ודרישות הכנה מייגע.
מטרת המחקר הנוכחי הייתה לפתח שיטה מדויקת ויעילה לבדיקות ביו-מכנית מתיחה של גידים מורקיים, התמקדות בסופראספיאטוס ובגידים אכילס כדוגמאות. באמצעות שילוב של 3D שחזורים מאנטומית העצם יליד, מידול מוצק, ואת הייצור התוסף, פותחה שיטה הרומן כדי לאחוז את העצמות. אביזרים אלה מאובטח ביעילות את העצמות, מנעו לוחית הצמיחה כשל, ירד זמן הכנת דגימה, והגדילה בדיקות מוגברת. השיטה החדשה היא להתאמה בקלות כדי לבדוק גידים murine אחרים, כמו גם הגידים של חולדות ובעלי חיים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מודלים בעלי חיים מוריין משמשים בדרך כלל כדי ללמוד הפרעות גיד, אבל האפיון של תכונות מכניות שלהם הוא מאתגר נדיר בספרות. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר שיטה יעילה ומתוכעת לבדיקת מתיחה של גידים מורקיים. השיטות החדשות הפחיתו את הזמן הנדרש לבדיקת מדגם משעות לדקות ובוטלו חפץ מרתק גדול שהיה בעיה נפוצה …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר היה נתמך על ידי NIH/NIAMS (R01 AR055580, R01 AR057836).
Materials
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | Dissovle 1g in 100 ml ultrapure water to make 1% agarose |
| Bruker microCT | Bruker BioSpin Corp | Skyscan 1272 | Used by authors |
| ElectroForce | TA Instruments | 3200 | Testing platform |
| Ethanol 200 Proof | Fisher Scientific | A4094 | Dilute to 70% and use as suggested in protocol |
| Fixture to attach grips | Custom made | Used by authors | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | S-8115 | As suggested in protocol |
| MicroCT CT-Analyser (Ctan) | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| MilliQ water (Ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | 100 ml |
| Meshmixer | Autodesk | http://www.meshmixer.com/ | Free engineering software used by authors to refine mesh |
| Objet EDEN 260VS | Stratasys LTD | Precision Prototyping | |
| Objet Studio | Stratasys LTD | Used by authors with 3D printer | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 10010031 | 2.5 L of 10% PBS |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | Used by authors |
| Scalpel Blade – #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | Used by authors |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Used by authors |
| SkyScan 1272 | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| Skyscan CT-Vox | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| SkyScan NRecon | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| SolidWorks CAD | Dassault Systèmes | SolidWorks Research Subsription | Solid modeling computer-aided design used by authors |
| SuperGlue | Loctite | 234790 | As suggested in protocol |
| Testing bath | Custom made | Used by authors | |
| Thin film grips | Custom made | Used by authors | |
| VeroWhitePlus | Stratasys LTD | NA | 3D printing material used by authors |
| WinTest | WinTest Software | Used by authors to collect data |
References
- Girish, N., Ramachandra, K., Arun, G. M., Asha, K. Prevalence of Musculoskeletal Disorders Among Cashew Factory Workers. Archives of Environmental & Occupational Health. 67, 37-42 (2012).
- Thomopoulos, S., Parks, W. C., Rifkin, D. B., Derwin, K. A. Mechanisms of tendon injury and repair. Journal of Orthopaedic Research. 33, 832-839 (2016).
- Scott, A., Ashe, M. C. Common Tendinopathies in the Upper and Lower Extremities. Current Sports Medicine Reports. 5, 233-241 (2006).
- Praemer, A., Furner, S., Rice, D. P. Musculoskeletal Conditions in the United States. American Academy of Orthopaedic Surgeons. , (1992).
- Nourissat, G., Berenbaum, F., Duprez, D. Tendon injury: From biology to tendon repair. Nature Reviews Rheumatology. 11, 223-233 (2015).
- Galatz, L. M., Ball, C. M., Teefey, S. A., Middleton, W. D., Yamaguchi, K. The outcome and repair integrity of completely arthroscopically repaired large and massive rotator cuff tears. The Journal of Bone and Joint Surgery. 86, 219-224 (2004).
- Sher, J. S., Uribe, J. W., Posada, A., Murphy, B. J., Zlatkin, M. B. Abnormal findings on magnetic resonance images of asymptomatic shoulders. The Journal of Bone and Joint Surgery. 77, 10-15 (1995).
- Ker, R. F., Wang, X. T., Pike, A. V. Fatigue quality of mammalian tendons. The Journal of Experimental Biology. 203, 1317-1327 (2000).
- Wilson, J. J., Best, T. M. Common overuse tendon problems: A review and recommendations for treatment. American Family Physician. 72, 811-818 (2005).
- Fleischer, J., et al. Biomechanical strength and failure mechanism of different tubercula refixation methods within the framework of an arthroplasty for shoulder fracture. Orthopaedics & Traumatology: Surgery & Research. 103, 165-169 (2017).
- West, J. R., Juncosa, N., Galloway, M. T., Boivin, G. P., Butler, D. L. Characterization of in vivo Achilles tendon forces in rabbits during treadmill locomotion at varying speeds and inclinations. Journal of Biomechanics. 37, 1647-1653 (2004).
- Cavinatto, L., et al. Early versus late repair of rotator cuff tears in rats. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 27, 606-613 (2018).
- Potter, R., Havlioglu, N., Thomopoulos, S. The developing shoulder has a limited capacity to recover after a short duration of neonatal paralysis. Journal of Biomechanics. 47, 2314-2320 (2014).
- Connizzo, B. K., Sarver, J. J., Iozzo, R. V., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. Effect of Age and Proteoglycan Deficiency on Collagen Fiber Re-Alignment and Mechanical Properties in Mouse Supraspinatus Tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 135, 021019 (2013).
- Beason, D. P., et al. Hypercholesterolemia increases supraspinatus tendon stiffness and elastic modulus across multiple species. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22, 681-686 (2013).
- Miller, K. S., Connizzo, B. K., Soslowsky, L. J. Collagen fiber re-alignment in a neonatal developmental mouse supraspinatus tendon model. Annals of Biomedical Engineering. 40, 1102-1110 (2012).
- Cong, G. T., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: Development and analysis of a novel murine model. Journal of Orthopaedic Research. 36, 2780-2788 (2018).
- Thomopoulos, S., Birman, V., Genin, G. M. Structural Interfaces and Attachments in Biology. Infection and Immunity. 35, (2013).
- Boivin, G. P., et al. Biomechanical properties and histology of db/db diabetic mouse Achilles tendon. Muscles, Ligaments and Tendons Journal. 4, 280-284 (2014).
- Ansorge, H. L., Adams, S., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. Mechanical, Compositional, and Structural Properties of the Post-natal Mouse Achilles Tendon. Annals of Biomedical Engineering. 39, 1904-1913 (2011).
- Shu, C. C., Smith, M. M., Appleyard, R. C., Little, C. B., Melrose, J. Achilles and tail tendons of perlecan exon 3 null heparan sulphate deficient mice display surprising improvement in tendon tensile properties and altered collagen fibril organisation compared to C57BL/6 wild type mice. PeerJ. 6, 5120 (2018).
- Probst, A., et al. A new clamping technique for biomechanical testing of tendons in small animals. Journal of Investigative Surgery. 13, 313-318 (2000).
- Talan, M. Body temperature of C57BL/6J mice with age. Experimental Gerontology. 19, 25-29 (1984).
- Newton, M. D., et al. The influence of testing angle on the biomechanical properties of the rat supraspinatus tendon. Journal of Biomechanics. 49, 4159-4163 (2016).
- Schwartz, A. G., Lipner, J. H., Pasteris, J. D., Genin, G. M., Thomopoulos, S. Muscle loading is necessary for the formation of a functional tendon enthesis. Bone. 55, 44-51 (2014).
- Gimbel, J. A., Van Kleunen, J. P., Williams, G. R., Thomopoulos, S., Soslowsky, L. J. Long durations of immobilization in the rat result in enhanced mechanical properties of the healing supraspinatus tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 129, 400-404 (2006).
- Freedman, B. R., Sarver, J. J., Buckley, M. R., Voleti, P. B., Soslowsky, L. J. Biomechanical and structural response of healing Achilles tendon to fatigue loading following acute injury. Journal of Biomechanics. 47, 2028-2034 (2014).
- Deymier, A. C., et al. The multiscale structural and mechanical effects of mouse supraspinatus muscle unloading on the mature enthesis. Acta Biomaterialia. 83, 302-313 (2019).
- Killian, M. L., Thomopoulos, S. Scleraxis is required for the development of a functional tendon enthesis. FASEB Journal. 30, 301-311 (2016).
- Schwartz, A. G., Long, F., Thomopoulos, S. Enthesis fibrocartilage cells originate from a population of Hedgehog-responsive cells modulated by the loading environment. Development. 142, 196-206 (2015).
- Bell, R., Taub, P., Cagle, P., Flatow, E. L., Andarawis-Puri, N. Development of a mouse model of supraspinatus tendon insertion site healing. Journal of Orthopaedic Research. 33, 25-32 (2014).
- Connizzo, B. K., Bhatt, P. R., Liechty, K. W., Soslowsky, L. J. Diabetes Alters Mechanical Properties and Collagen Fiber Re-Alignment in Multiple Mouse Tendons. Annals of Biomedical Engineering. 42, 1880-1888 (2014).
- Eekhoff, J. D., et al. Functionally Distinct Tendons From Elastin Haploinsufficient Mice Exhibit Mild Stiffening and Tendon-Specific Structural Alteration. Journal of Biomechanical Engineering. 139, 111003 (2017).
- Mikic, B., Bierwert, L., Tsou, D. Achilles tendon characterization in GDF-7 deficient mice. Journal of Orthopaedic Research. 24, 831-841 (2006).
- Sikes, K. J., et al. Knockout of hyaluronan synthase 1, but not 3, impairs formation of the retrocalcaneal bursa. Journal of Orthopaedic Research. 36, 2622-2632 (2018).
- Wang, V. M., Banack, T. M., Tsai, C. W., Flatow, E. L., Jepsen, K. J. Variability in tendon and knee joint biomechanics among inbred mouse strains. Journal of Orthopaedic Research. 24, 1200-1207 (2006).
- Wang, V. M., et al. Murine tendon function is adversely affected by aggrecan accumulation due to the knockout of ADAMTS5. Journal of Orthopaedic Research. 30, 620-626 (2011).
- Zhang, K., et al. Tendon mineralization is progressive and associated with deterioration of tendon biomechanical properties, and requires BMP-Smad signaling in the mouse Achilles tendon injury model. Matrix Biology. 52-54, 315-324 (2016).
- Rooney, S. I., et al. Ibuprofen differentially affects supraspinatus muscle and tendon adaptations to exercise in a rat model. American Journal of Sports Medicine. 44, 2237-2245 (2016).
- Galasso, O., et al. Quality of Life and Functional Results of Arthroscopic Partial Repair of Irreparable Rotator Cuff Tears. Arthroscopy – Journal of Arthroscopic and Related Surgery. 33, 261-268 (2017).
- Sarver, D. C., et al. Sex differences in tendon structure and function. Journal of Orthopaedic Research. 35, 2117-2126 (2017).
- Razmjou, H., et al. Disability and satisfaction after Rotator Cuff decompression or repair: A sex and gender analysis. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 66 (2011).
