Test biomeccanici di Murine Tendons
Summary
Il protocollo descrive metodi di test biomeccanici tesi efficienti e riproducibili per i tendini murini attraverso l’uso di apparecchi stampati in 3D personalizzati.
Abstract
I disturbi del tendone sono comuni, colpiscono persone di tutte le età e sono spesso debilitanti. I trattamenti standard, come i farmaci antinfiammatori, la riabilitazione e la riparazione chirurgica, spesso falliscono. Al fine di definire la funzione del tendine e dimostrare l’efficacia di nuovi trattamenti, le proprietà meccaniche dei tendini dei modelli animali devono essere determinate con precisione. I modelli animali Murine sono ora ampiamente utilizzati per studiare disturbi del tendine e valutare nuovi trattamenti per le tendinopatie; tuttavia, determinare le proprietà meccaniche dei tendini del topo è stato difficile. In questo studio è stato sviluppato un nuovo sistema per i test meccanici tendini che include apparecchi stampati in 3D che corrispondono esattamente alle anatomie dell’omero e del calcano per testare meccanicamente i tendini supraspinati e i tendini di Achille, rispettivamente. Questi apparecchi sono stati sviluppati utilizzando ricostruzioni 3D di anatomia ossea nativa, modellazione solida e produzione additiva. Il nuovo approccio ha eliminato i fallimenti di presa reali (ad esempio, il fallimento al guasto della piastra di crescita piuttosto che nel tendine), ha ridotto i tempi complessivi di test e ha aumentato la riproducibilità. Inoltre, questo nuovo metodo è facilmente adattabile per testare altri tendini murini e tendini di altri animali.
Introduction
I disturbi del tendone sono comuni e altamente diffusi tra le popolazioni anziane, atletiche e attive1,2,3. Negli Stati Uniti, ognianno vengono segnalate 16,4 milioni di lesioni ai visibili connettivi e rappresentano il 30% di tutte le visite all’ufficio medico correlate alle lesioni3,5,6,7, 8. I siti più comunemente colpiti includono la cuffia dei rotatori, il tendine di Achille e il tendine rotuleo9. Sebbene siano stati esplorati una varietà di trattamenti non operativi e operativi, tra cui farmaci antinfiammatori, riabilitazione e riparazione chirurgica, gli esiti rimangono scarsi, con un ritorno limitato alla funzione e alti tassi di fallimento5, 6. Questi scarsi esiti clinici hanno motivato studi di base e traslazionali che cercano di comprendere la tendinopatia e di sviluppare nuovi approcci di trattamento.
Le proprietà biomeccaniche della tensione sono i principali risultati quantitativi che definiscono la funzione tendinea. Pertanto, la caratterizzazione di laboratorio della tendinopatia e l’efficacia del trattamento devono includere un rigoroso test delle proprietà della tensione del tendine. Numerosi studi hanno descritto metodi per determinare le proprietà biomeccaniche dei tendini da modelli animali come ratti, pecore, cani e conigli10,11,12. Tuttavia, pochi studi hanno testato le proprietà biomeccaniche dei tendini murini, principalmente a causa delle difficoltà nell’afferrare i piccoli tessuti per il test della tensione. Poiché i modelli murini hanno numerosi vantaggi per studiare meccanicamente la tendinopatia, tra cui la manipolazione genetica, ampie opzioni di reagente e i metodi a basso costo, è necessario lo sviluppo di metodi accurati ed efficienti per testare biomeccanicamente i tessuti murini.
Al fine di testare correttamente le proprietà meccaniche dei tendini, il tessuto deve essere attanagliato in modo efficace, senza scivolare o strappo artifeffettiva all’interfaccia di presa o fratturazione della piastra di crescita. In molti casi, in particolare per i tendini corti, l’osso è afferrato su un’estremità e il tendine è afferrato sull’altra estremità. Le ossa sono tipicamente protette incorporandole in materiali come la resina epossidica13 e il polimetilelmethacritil14,15. Tendoni sono spesso collocati tra due strati di carta vetrata, incollati con cianoacrilato, e fissati utilizzando morsetti di compressione (se la sezione trasversale è piatta) o in un mezzo congelato (se la sezione trasversale è grande)15,16,17 . Questi metodi sono stati applicati per testare biomeccanicamente i tendini murini, ma le sfide sorgono a causa delle piccole dimensioni degli esemplari e del rispetto della piastra di crescita, che non ossifica mai18. Ad esempio, il diametro della testa omerale murina è di pochi millimetri, rendendo così difficile la presa dell’osso. In particolare, il test della tensione di campioni di murine supraspinatus tendino-osso spesso si traduce in fallimento alla piastra di crescita piuttosto che nel tendine o nell’entesi del tendine. Allo stesso modo, il test biomeccanico del tendine d’Achille è impegnativo. Anche se il tendine d’Achille è più grande di altri tendini murini, il calcaneus è piccolo, rendendo difficile la presa di questo osso. L’osso può essere rimosso, seguito da afferrare le due estremità del tendine; tuttavia, ciò preclude la prova dell’attaccamento tendine-osso. Altri gruppi riferiscono di afferrare l’osso di calcaneus utilizzando apparecchi su misura19,20, ancoraggio da morsetti21, fissaggio in auto cura cemento plastica22 o utilizzando una forma conica slot22, ma questi i metodi precedenti rimangono limitati da una bassa riproducibilità, da elevati tassi di guasto e da noiosi requisiti di preparazione.
L’obiettivo dello studio attuale era quello di sviluppare un metodo accurato ed efficiente per il test biomeccanico della tensione dei tendini murini, concentrandosi sui tendini sopraspinati e achille come esempi. Utilizzando una combinazione di ricostruzioni 3D dall’anatomia ossea nativa, dalla modellazione solida e dalla produzione additiva, è stato sviluppato un nuovo metodo per afferrare le ossa. Questi apparecchi fissavano efficacemente le ossa, prevenivano il fallimento della piastra di crescita, riducevano i tempi di preparazione dei campioni e aumentavano la riproducibilità dei test. Il nuovo metodo è facilmente adattabile per testare altri tendini murini così come tendini nei ratti e in altri animali.
Protocol
Representative Results
Discussion
I modelli animali Murine sono comunemente usati per studiare i disturbi del tendine, ma la caratterizzazione delle loro proprietà meccaniche è impegnativa e non comune nella letteratura. Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere un metodo efficiente e riproducibile nel tempo per il test della tensione dei tendini murini. I nuovi metodi hanno ridotto il tempo necessario per testare un campione da ore a minuti ed eliminato un elemento di presa importante che era un problema comune nei metodi precedenti.
<…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo studio è stato sostenuto dal NIH / NIAMS (R01 AR055580, R01 AR057836).
Materials
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | Dissovle 1g in 100 ml ultrapure water to make 1% agarose |
| Bruker microCT | Bruker BioSpin Corp | Skyscan 1272 | Used by authors |
| ElectroForce | TA Instruments | 3200 | Testing platform |
| Ethanol 200 Proof | Fisher Scientific | A4094 | Dilute to 70% and use as suggested in protocol |
| Fixture to attach grips | Custom made | Used by authors | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | S-8115 | As suggested in protocol |
| MicroCT CT-Analyser (Ctan) | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| MilliQ water (Ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | 100 ml |
| Meshmixer | Autodesk | http://www.meshmixer.com/ | Free engineering software used by authors to refine mesh |
| Objet EDEN 260VS | Stratasys LTD | Precision Prototyping | |
| Objet Studio | Stratasys LTD | Used by authors with 3D printer | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 10010031 | 2.5 L of 10% PBS |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | Used by authors |
| Scalpel Blade – #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | Used by authors |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Used by authors |
| SkyScan 1272 | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| Skyscan CT-Vox | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| SkyScan NRecon | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| SolidWorks CAD | Dassault Systèmes | SolidWorks Research Subsription | Solid modeling computer-aided design used by authors |
| SuperGlue | Loctite | 234790 | As suggested in protocol |
| Testing bath | Custom made | Used by authors | |
| Thin film grips | Custom made | Used by authors | |
| VeroWhitePlus | Stratasys LTD | NA | 3D printing material used by authors |
| WinTest | WinTest Software | Used by authors to collect data |
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