정수리 상피 세포 활성화에 관여하는 통로를 분석하는 전 비보 분석으로 구체 아웃스승
Summary
이 문서는 마우스 신장에서 분리된 캡슐화된 사구체 사구류의 구체 정수리 세포 성장을 배양하고 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 정수리 상피 세포 증식 및 마이그레이션에 관여하는 경로를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
정수리 상피 세포 (PEC) 활성화는 글로메룰로오스 경화증의 개발 및 진행에 관여하는 주요 요인 중 하나입니다. 따라서 정수리 상피 세포 활성화에 관여하는 통로의 억제는 구엽 질병의 진행을 감쇠하는 도구가 될 수 있습니다. 이 문서에서는 마우스 신장으로부터 분리된 캡슐화된 사구류의 정수리 상피 세포 내 성장을 배양하고 분석하는 방법을 설명합니다. 고립 된 마우스 신장을 해부 한 후, 조직은 다진, 그리고 사구는 체질에 의해 격리된다. 캡슐화된 사구는 수집되고, 단일 사구는 정수리 상피 세포의 구체 배설물 성장을 얻기 위해 6 일 동안 배양된다. 이 기간 동안, 정수리 상피 세포 증식 및 이동은 세포 수 또는 성장하는 세포의 표면적을 결정함으로써 분석될 수 있다. 이 분석은 그러므로 형질 전환기 또는 녹아웃 마우스에 있는 변경한 유전자 발현의 효력 또는 정수리 상피 세포 성장 특성 및 신호에 배양 조건의 효력을 연구하기 위하여 공구로 이용될 수 있습니다. 이 방법을 사용하여, 정수리 상피 세포 활성화 과정에 관여 하고 결과적으로 구체 로메로클로증에서 관련 된 중요 한 경로 연구 될 수 있다.
Introduction
구체 질환은 신장 질환의 중요한 그룹이며 말기 신장 질환 (ESRD)의 주요 원인을 나타냅니다. 불행히도, 특정 치료 옵션은 제한적이며 ESRD로의 진행은 불가피합니다. 구체 질환은 사구체 손상의 존재에 의해 정의되며 염증 성 및 비 염증 성 질환으로 그룹화 될 수 있습니다. 초기 모욕은 다르지만, 최근 연구에 따르면 일반적인 세포 메커니즘은 사구성 상피 세포 증식으로 이어지며 궁극적으로 모든 사구형 질환에서 사구체 경화증으로 이어지며 근본 원인11,2,,3,,4에관계없이.
구체적으로, 구체류경화성 병변은 주로 활성화된 정수리 성 상피 세포5,,6로구성된 것으로 나타났다. 생리학적 조건하에서, 정수리 상피 세포는 구체의 Bowman의 캡슐을 줄 이는 평평한 정지 상피 세포입니다. 그러나, 유전적 돌연변이(예를 들어, 포도세포 특이적 또는 미토콘드리아 세포병리학), 염증 또는 과여과(예를 들어, 신장 질량 감소, 고혈압, 비만 또는 당뇨병 성 멜리터스)으로 인한 모든 구체 손상은 정수리 세포의 활성화를 시작할 수 있다. 활성화된 정수리 상피 세포는 세포 초승달 또는 경화 병변의 형성을 초래하는 세포외 매트릭스를 증식하고 증착하고예금5,,7,,8. 이러한 프로세스의 진행은 신장 기능9의손실을 초래한다. 따라서, 정수리 상피 세포 활성화는 염증성 및 비염증성 구엽기 질환1,,2,,3,,4,,10모두에서 사구체 경화증의 발달 및 진행에 중요한 요소입니다.
정수리 상피 세포 활성화를 중재하는 분자 과정은 여전히 크게 알려지지 않았습니다. 최근 연구에 따르면 활성화된 정수리 상피 세포 드 노보 익스프레스 CD44, 세포 증식 및 마이그레이션에 관여하는 다른 경로의 활성화에 중요한 수용체. 더욱이, CD44의 억제는 정수리 상피 세포 활성화를 억제하고 염증성 뿐만 아니라 비염증성 구엽기질환(11,,12)의동물 모델에서 초승달 형성 및 구종증의 진행을 감쇠시키는 것으로 나타났다.
정수리 상피 세포 활성화는 사구체 경화증과 초승달 형성의 발달을위한 핵심 플레이어이기 때문에, 이 세포의 억제는 사구형 질병의 진행을 감속할 수 있었습니다. 정수리 상피 세포 활성화를 구동 하는 분자 경로의 용해성 구엽 질환에서 초플라스틱 및 구체 성 병 변의 형성을 감쇠 특정 치료 개입의 개발로 이어질 수 있습니다.
실험적인 동물 모델에서는, 정수리 상피 세포에 변경된 유전자 발현(녹아웃 모델 또는 형질전환 마우스 모형) 또는 약물 치료의 직접적인 효력에 대한 증거를 제공하기가 빈번하게 어렵습니다. 기존의 녹아웃 마우스에서 생체 내에서 관찰된 생체 내 변화는 정수리 상피 세포의 직접적인 변화에 의해 설명될 수 있다. 그러나, 유전자 발현은 마우스 내의 다른 세포 유형에서도 변경되기 때문에, 다른 세포 유형에 의해 매개되는 간접적인 효력을 배제할 수 없다. 정수리 상피 세포에서 주로 활성 프로모터에 의해 구동 조건부 cre-lox 마우스의 개발은 어떤 경우에는 용액을 제공하고있다 13. 그럼에도 불구하고 조건부 형질 전환 모델은 복잡하고 더 많은 조건부 라인을 사용할 수 있지만, 기존의 녹아웃 또는 형질전환 마우스 라인의 많은 경우 아직 조건부 대체가 없습니다.
정수리 상피 세포에 대한 직접적인 효과를 연구하기 위해 우리 그룹은 정수리 상피 세포 증식 및 이동을 측정하고 분석하기 위해 마우스 신장에서 분리 된 단일 캡슐형 사구를 사용하여 전 생체 분석기를 개발했습니다. 이 방법은 정수리 상피 세포 특정 효과를 결정하고 정수리 상피 세포 활성화 및 테스트 치료 옵션에 대한 책임있는 경로를 찾을 수 있게 해 주어 이 활성화를 억제할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에 설명된 프로토콜을 사용하여, 하나는 정수리 상피 세포 활성화의 결과인 정수리 상피 세포 증식을 평가하기 위하여 단 하나 캡슐화된 구체를 사용할 수 있습니다. 이 전 생체 내 모델은 우리가 정수리 상피 세포 활성화에 관여하는 분자 경로를 자세히 연구 할 수 있게 합니다. 설명된 방법은 신장 해부및 체질의 간단한 개념에 의존하여 탈구를 분리하고 배양하고 상이한 실험 조건 하에?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 네덜란드 신장 재단에 의해 지원 되었다 (보조금 14A3D104) 과학적 연구를 위한 네덜란드 조직 (NWO VIDI 교부금: 016.156.363).
Materials
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | |
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | |
| EBM Medium | Lonza | |
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | |
| Fetal Calf Serum | Lonza | |
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | |
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | |
| ImageJ software | FIJI 1.51n | |
| petri dish | Sarstedt | size 100 |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
References
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