Crecimiento glomerular como ensayo ex vivo para analizar las rutas involucradas en la activación de células epiteliales parietales
Summary
Este artículo describe un método para cultivar y analizar los crecimientos de células epiteliales parietales glollares de glomérulos encapsulados aislados del riñón de ratón. Este método se puede utilizar para estudiar las vías implicadas en la proliferación y migración de células epiteliales parietales.
Abstract
La activación de la célula epitelial parietal (PEC) es uno de los factores clave involucrados en el desarrollo y progresión de la glomerulosclerosis. Por lo tanto, la inhibición de las vías implicadas en la activación de células epiteliales parietales podría ser una herramienta para atenuar la progresión de las enfermedades glomerulares. Este artículo describe un método para cultivar y analizar el crecimiento de células epiteliales parietales de glomérulos encapsulados aislados del riñón de ratón. Después de diseccionar los riñones aislados de ratón, el tejido se pica, y los glomérulos se aíslan por tamizado. Se recogen glomérulos encapsulados, y se cultivan 6 días para obtener el crecimiento glomerular de células epiteliales parietales. Durante este período, la proliferación y migración de células epiteliales parietales se puede analizar determinando el número de célula o el área de superficie de las células que crecen. Por lo tanto, este ensayo puede utilizarse como herramienta para estudiar los efectos de una expresión génica alterada en ratones transgénicos o noqueadores o los efectos de las condiciones de cultivo en las características de crecimiento y señalización de células epiteliales parietales. Utilizando este método, se pueden estudiar vías importantes implicadas en el proceso de activación celular epitelial parietal y, en consecuencia, en la glomerulosclerosis.
Introduction
Las enfermedades glomerulares son un grupo importante de trastornos renales y representan una de las principales causas de la enfermedad renal terminal(ESRD). Desafortunadamente, las opciones de tratamiento específicas son limitadas y la progresión a la ESRD es inevitable. Las enfermedades glomerulares se definen por la presencia de lesiones glomerulares y pueden agruparse en enfermedades inflamatorias y no inflamatorias. Aunque el insulto inicial es diferente, estudios recientes han demostrado que un mecanismo celular común conduce a la hiperplasia celular epitelial glomerular y, en última instancia, a la glomerulosclerosis en todas las enfermedades glomerulares, independientemente de la causa subyacente1,,2,,3,4.
Específicamente, se demostró que las lesiones glomeruloscleróticas se componen principalmente de células epiteliales parietales activadas5,6. En condiciones fisiológicas, las células epiteliales parietales son células epiteliales en reposo planas que recubren la cápsula del Bowman del glomerulo. Sin embargo, cualquier lesión glomerular ya sea debido a mutaciones genéticas (por ejemplo, citopatías de podocitos específicos o mitocondriales), inflamación o hiperfiltración (por ejemplo, causada por la reducción de la masa renal, hipertensión, obesidad o mellitus diabético) puede desencadenar la activación de células epiteliales parietales. Las células epiteliales parietales activadas proliferan y depositan matriz extracelular que resulta en la formación de media lunas celulares o lesiones escleróticas5,7,8. La progresión de estos procesos da lugar a la pérdida de la función renal9. Por lo tanto, la activación celular epitelial parietal es un factor clave en el desarrollo y progresión de la glomerulosclerosis tanto en enfermedades glomerulares inflamatorias como no inflamatorias1,,2,,3,,4,,10.
Los procesos moleculares que median la activación de células epiteliales parietales son aún desconocidos en gran medida. Estudios recientes muestran que las células epiteliales parietales activadas de novo express CD44, un receptor que es importante para la activación de diferentes vías implicadas en la proliferación celular y la migración. Además, se demostró que la inhibición de CD44 inhibe la activación de células epiteliales parietales y atenúa la progresión de la formación de media luna y la glomerulosclerosis en modelos animales de enfermedades glomerulares inflamatorias y no inflamatorias11,12.
Como la activación de células epiteliales parietales es un actor clave para el desarrollo de la glomerulosclerosis y la formación de media luna, la inhibición de estas células podría ralentizar la progresión de las enfermedades glomerulares. La elucidación de las vías moleculares que impulsan la activación celular epitelial parietal puede conducir al desarrollo de intervenciones terapéuticas específicas que atenúen la formación de lesiones hiperplásicas y glomeruloscleróticas en la enfermedad glomerular.
En modelos animales experimentales, con frecuencia es difícil proporcionar evidencia para un efecto directo de una expresión génica alterada (modelos de eliminación o modelos de ratón transgénicos) o tratamiento farmacológico en las células epiteliales parietales. En un ratón noqueado convencional, los cambios in vivo observados podrían explicarse por cambios directos en las células epiteliales parietales. Sin embargo, dado que la expresión génica también se altera en otros tipos de células dentro del ratón, no se pueden excluir los efectos indirectos mediados por otros tipos de células. El desarrollo de ratones cre-lox condicionales impulsados por promotores principalmente activos en células epiteliales parietales ha proporcionado una solución en algunos casos13. Sin embargo, los modelos transgénicos condicionales son complejos y aunque hay más líneas condicionales disponibles, para muchas de las líneas convencionales de ratón noqueado o transgénico aún no hay un sustituto condicional.
Para estudiar los efectos directos sobre las células epiteliales parietales, nuestro grupo ha desarrollado un ensayo ex vivo utilizando glomérulos encapsulados aislados de los riñones de ratón para medir y analizar la proliferación y migración de células epiteliales parietales. Este método nos permitirá determinar los efectos específicos de las células epiteliales parietales y encontrar vías responsables para la activación de células epiteliales parietales y probar opciones de tratamiento para inhibir esta activación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Usando el protocolo descrito en este artículo, se puede utilizar glomérulos encapsulados individuales para evaluar la proliferación de células epiteliales parietales que es una consecuencia de la activación de células epiteliales parietales. Este modelo ex vivo nos permitirá estudiar en detalle las vías moleculares, que intervienen en la activación de células epiteliales parietales. El método descrito se basa en el concepto simple de disección renal y tamizado para aislar y cultivar glomérulos encapsulados y…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por la Fundación Riñón Holandesa (concesión 14A3D104) y la Organización Neerlandesa para la Investigación Científica (subvención NWO VIDI: 016.156.363).
Materials
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | |
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | |
| EBM Medium | Lonza | |
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | |
| Fetal Calf Serum | Lonza | |
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | |
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | |
| ImageJ software | FIJI 1.51n | |
| petri dish | Sarstedt | size 100 |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
References
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