Summary
이 프로토콜은 살아있는 3차원 이미징을 위해 세균 샘플을 준비하고 장착하는 방법과 이러한 이미지에서 대장균의 3차원 모양을 재구성하는 방법을 설명합니다.
Abstract
박테리아의 모양은 생리학에 중요합니다. 세포 운동성, 세포 및 생물막 생산과 같은 세포 생리학의 많은 양상은 세포 모양에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 세균성 세포는 거의 같이 취급되지 않더라도, 3차원 (3D) 객체입니다. 대부분의 현미경 기술은 단백질의 실제 3D 세포 모양 그리고 현지화에 관련되는 데이터의 손실로 이끌어 내는 2 차원 (2D) 심상을 초래합니다. 가우시안 곡률(두 주 곡률의 곱)과 같은 특정 모양 매개변수는 2D 이미지가 두 주 곡률을 모두 측정하지 않기 때문에 3D로만 측정할 수 있습니다. 추가적으로, 모든 세포는 구부이근 세포의 설치 및 2D 화상 진찰이 정확하게 이 세포의 모양을 나타내지 않을 수 있습니다 때 평평하게 놓이지 않습니다. 3D로 단백질 국소화를 정확하게 측정하면 단백질의 공간 조절 및 기능을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 3D 세포 모양을 재구성하고 정확하게 단백질을 현지화하기 위해 현미경의 흐림 기능을 사용하는 전방 컨볼루션 기술이 개발되었습니다. 여기서, 정확한 세포 형상을 재구성하고 단백질을 국소화하기 위해 박테리아의 살아있는 세포 이미징을 위한 샘플을 3D로 준비하고 장착하기 위한 프로토콜이 설명된다. 이 방법은 간단한 샘플 준비, 형광 이미지 수집 및 MATLAB 기반 이미지 처리를 기반으로 합니다. 많은 고품질 형광 현미경은 이러한 측정을 위해 간단하게 수정할 수 있습니다. 이러한 셀 재구성은 계산 집약적이며, 필요하지는 않지만 처리량이 많은 계산 리소스에 액세스하는 것이 좋습니다. 이 방법은 여러 세균 종 및 돌연변이, 형광 이미징 양식 및 현미경 제조업체에 성공적으로 적용되었습니다.
Introduction
모든 유형의 세포는 특정 기능에 대한 모양을 조절합니다. 예를 들면, 신경은 혈액 세포와 다르게 모양이고 다른 기능이 있습니다. 유사하게, 세균성 세포는 이 모양의 목적이 항상1,2를알려져 있지 않더라도, 모양 및 크기의 다양한에서 옵니다. 따라서 세균 세포의 모양을 정확하게 결정하는 것이 중요합니다. 설명된 방법은 대부분의 살아있는 또는 고정된 세균 세포의 3D 분석에 적합한 데이터를 수집하는 용이하게 구현된 방법을 보여줍니다.
설명된 방법은 정확하게 견본의 3D 세포 모양을 정확하게 표현하고 이 모양 내의 단백질을 정확하게 현지화하기 위하여 세균성 세포의 3D 심상을 취하는 것을 가능하게 합니다. 전통적인 현미경 검사법은 대장균의돌연변이체 또는 비브리오 콜레라및 헬리코박터와 같은 구부러진 박테리아와 같이 비정상적이거나 비대칭적인 모양이 있는 세포를 공부할 때 문제가 되는 2D 심상을 취합니다. 파일로리. 고해상도 3D 이미지가 이 메서드의 핵심 입력이지만 이 메서드는 해상도가 향상된 이미지를 반환하지 않습니다. 오히려, 이 방법은활성 윤곽과 현미경3의 명백한 흐림 기능을 사용하여 전방 컨볼루션 알고리즘을 사용하여 셀의 3D 표면 좌표와 모양을 재구성합니다(그림1). 대장균4,5,6,7, V. 콜레라8의소설 periskeletal element CrvA, 및 가식성에서 세균 작용 상동성 MreB를 연구하는 데 사용되어 왔다. 헬리코박터 파일로리의바토필린 CcmA9 (그림 2).
단백질의 국소화는 그들의 기능에 대한 통찰력을 줄 수 있습니다. 예를 들어, 세포 분열에 관여하는 단백질은 일반적으로 미드셀10,11에국한된다. 높은 처리량 연구는 그들의 기능에 대한 통찰력을 얻기의 희망에 박테리아의 모든 단백질을 지역화하기 위해 착수되었습니다12. 불행히도, 이 연구 결과는 2D 화상 진찰및 1D 또는 2D 분석으로, 세포 기하학적 특징에 현지화와 같은 단백질 국소화의 특정 양상을 측정하는 것을 불가능하게 했습니다.
예를 들어, 많은 박테리아의 막대 형상에 필요한 동적 단백질인 MreB는 세포벽 합성의 국소화를 지시하여 작동하도록 가설되고, 그 국소화는 세포벽 합성의국소화를반영한다7,13. 여러 종의 MreB는 기하학적 농축4,6,7,14,15를보여줍니다. MreB와 같은 동적 표면 중합체는 표면의 기하학적 형상을 시간 평균 농축프로파일(16)에 결합할 수 있으며멤브레인(17)에결합하는 것과 관련된 에너지를 최소화함으로써 특정 기하학적구조로 방향을 지정할 수 있다. MreB에 대해 비틀림, 번들링, 굽힘 및 역학의 중요성이 완전히 해결되지는 않았지만 표면의 두 주요 곡률을 정확하게 측정하려면 셀의 전체 3D 표현이 필요합니다. 따라서 단백질이 국소화되는 곡률을 가장 정확하게 측정하기 위해 2D 이미징보다는 3D를 사용하는 것이 우선입니다. 3D 이미징은 2D로 측정할 수 없는 곡률을 계산하여 추정할 필요가 없으며, 비대칭셀18에서정확하지 않을 수 있는 추정치입니다.
세포의 2D 이미징이 더 빠르고 많은 포스트 이미징 계산 작업을 필요로하지 않지만, 3D 이미징은 세포의 보다 정확한 표현뿐만 아니라 2D로 측정 할 수없는 곡률과 같은 표면 특징을 측정 할 수있는 기능을 제공합니다. 따라서 3D 이미징이 일반화됨에 따라 세포 모양과 단백질 국소화에 대한 새로운 통찰력이 가능해질 것입니다.
Protocol
1. 견본 준비
- 세포질 형광 단백질6을 발현하기 위하여 그(것)들을 기술하거나 막 염료5를사용하여 화상 진찰을 위한 대장균 형광을 확인하십시오. 다른 세균성 종은 대장균대신 사용할 수 있습니다.
- 세포질 mCherry 형광 단백질을 인코딩하는 플라스미드로 전기 개공을 통해 세포를 변형시킵니다.
참고: 다른 색의 다른 형광 단백질을 사용할 수 있습니다. - 37°C에서 적절한 항생제로 LB 플레이트상에서 형질변형제를 성장시킨다. 단일 식민지를 얻고 현미경 검사법에 의해 긍정적 인 클론을 식별합니다. 현미경의 밑에 빨간 나타나는 항생 저항하는 식민지는 mCherry를 운반하는 플라스미드를 포함합니다.
- 세포질 mCherry 형광 단백질을 인코딩하는 플라스미드로 전기 개공을 통해 세포를 변형시킵니다.
- LB 액상 배지에서 37°C에서 적절한 항생제를 사용하여 밤새 배양한 2 mL를 흔들어 인큐베이터에서 성장시다. 접시에서 식민지 또는 접종으로 냉동고 주식의 소량을 사용.
참고: 실험에 선택된 세균 세포에 필요한 매체를 사용한다. - 하룻밤 배양 1:1,000을 신선한 LB 배지의 5 mL로 배양하고 3-4 h에 대한 흔들림 인큐베이터에서 37°C에서 기하급수적으로 세포가 성장하게 하여 세포의 OD600을 측정하여 지수상상에 있는지 확인하였다(즉. , OD600 = 0.2−0.4).
참고: 이미징은 수행되는 실험에 따라 임의의 성장 단계에서 수행될 수 있다.
2. 슬라이드 준비
참고: 자가형광이 낮은 미디어를 사용하는 것이 중요합니다. 낮은 자가형광이 있는 모든 배지를 사용할 수 있습니다. 본 실험에서, 1% 아가로즈 M63 최소 미디어 패드 및 VaLaP19로 밀봉하는 것은 3D로 세포를 이미지화하는 데 필요하다.
-
최소 20 mL의 아가로즈 용액을 1% 준비합니다.
- 아가로즈가 완전히 용해되고 용액이 선명하게 나타날 때까지 용액을 전자레인지에 돌리자.
- 사용 준비가 될 때까지 용액을 60°C 수조에 보관하십시오.
참고: 이 용액은 필요에 따라 고화 및 용융될 수 있거나 필요에 따라 용융되는 더 적은 양으로 aliquoted할 수 있습니다. 여러 번 사용한 후에는 미디어가 변색되어 교체해야 합니다.
- 80-100 °C의 핫 플레이트에 VaLaP 실란트를 녹입니다.
참고: 80-100°C의 열판상에 비커에 각각 50 g의 석유 젤리, 라놀린 및 파라핀을 함께 녹여 실란트로 사용할 VaLaP를 준비한다. 이 다량의 VaLaP는 실온에서 무기한 으로 보관할 수 있으며 >500 슬라이드에 충분합니다. >100 °C에서 가열하면 성능이 저하되고 색상이 어두워집니다. - 슬라이드의 반대쪽 끝에 각각 2개의 20mm x 20mm 커버 슬립 3개씩 두 개의 스택을 놓습니다(총 6개의 커버슬립).
- 슬라이드에 아가로즈 패드 용액의 파이펫 200 μL.
참고: 엔지니어링형 형광 얼룩을 사용하지 않는 경우, 이 단계 전에 아가로즈 패드 용액에 막 염료를 첨가할 수 있다. 물에 염료를 다시 일시 중단하고 5 μg / mL의 최종 농도에 아가로즈 패드 용액의 1 mL에 염료를 추가합니다. - 즉시 단단히 한천을 평평하게 커버 슬립의 스택에 두 번째 슬라이드를 배치하고 실온에서 1 분 동안 고형화할 수 있습니다.
- 상단 슬라이드에서 조심스럽게 밀어 내십시오.
- 200 μL 파이펫 팁의 큰 끝을 사용하여 슬라이드의 젤 (~ 직경 ~ 5mm)에서 개별 패드를 잘라 내고 기형 또는 불필요한 젤을 폐기하십시오.
참고: 여러 균주 또는 조건을 이미징하는 경우, 각각에 대해 별도의 패드가 필요합니다. 하나의 변형만 이미지화할 수 있는 경우 커버슬립을 지원하기 위해 3-4 패드를 만드십시오. - 피펫 세포는 여러 번 위아래로 세포 덩어리를 방해하고 배양이 잘 혼합되도록합니다. 패드에 1.3 단계에서 서브 컬쳐의 피펫 1 μL.
참고: 세포 모양 재건은 그밖 세포를 건드리지 않는 개별적인 세포를 요구합니다. 고정상 또는 고세포 밀도 배양액을 사용하는 경우, 패드에 놓기 전에 샘플을 1:10 희석해야 할 수도 있다. - 샘플을 5-10분 동안 공기 건조시키십시오. 액체가 남아 있으면 세포가 액체 에서 움직이며 이미지화 할 수 없습니다.
- 덮개 슬립을 패드 상단에 놓습니다.
- 면봉으로 커버 슬립 가장자리를 부드럽게 닦아서 녹인 VaLaP로 커버 슬립을 밀봉합니다. 목적이 닿을 커버 슬립의 상단에서 멀리 하십시오. VaLaP는 몇 초 만에 경화되어 샘플을 밀봉합니다.
- 즉시 샘플을 이미지화합니다.
참고: 슬라이드가 준비되는 즉시 샘플을 이미지화해야 합니다. 세포는 패드에서 자랄 수 있으며, 분할하면 재건이 더 어려워질 것입니다.
3. 이미징 요구 사항
- 현미경의 z 또는 초점 축이 50 nm 미만의 정확한 움직임을 만들 수 있는지 확인하십시오. 일반적인 전동 초점 장치가 이 정밀도를 제공할 수 없기 때문에 연구 등급 현미경에서 사용할 수 있는 z 압전 단계(재료 표참조)를 사용합니다.
참고: 나이퀴스트 섀넌 샘플링기준(20)을가정하면 원하는 가장 작은 스텝 크기보다 0.5배, 원하는 공간 주파수의 2배를 이동할 수 있어야 합니다. 이 프로토콜에 필요한 100nm 단계의 경우 50nm 이하의 정밀도를 가진 단계가 필요합니다. -
현미경이 1.45의 최소 수치 조리개(NA)로 100x 목표를 포함하는지 확인합니다.
- 200-400개의 서로 다른 셀 사이의 z-stack을 수집하여 다운스트림 애플리케이션에 충분한 셀을 얻을 수 있도록 합니다.
참고: 필요한 셀의 수는 관심 샘플의 기본 가변성에 따라 달라집니다. 이 시점에서 수집 된 셀 중 일부는 재구성 단계를 통과하지 않습니다.
- 200-400개의 서로 다른 셀 사이의 z-stack을 수집하여 다운스트림 애플리케이션에 충분한 셀을 얻을 수 있도록 합니다.
- 이차 형광 채널(단백질, 대사 라벨 등)이 측정되는 경우 z-stack이 형상 채널에 사용되는 설정과 일치하는지 확인합니다.
4. 이미징
- 현미경실이 시료 제제실과 는 다른 온도에 있을 수 있기 때문에 밀봉된 슬라이드를 현미경에 삽입하고 5분 동안 앉아서 주변 환경과 온도를 평형화할 수 있도록 한다.
-
샘플의 형광 z 스택을 가져 가라.
참고: z-스택은 피사계 심도보다 작은 z 간격으로 샘플을 완전히 덮어야 합니다. 1.45 NA 100x 대물및 ~1 μm 두께의 대장균 세포의 경우, 단계당 100 nm에서 40단계가 잘 작동한다. 표면에 완벽하게 평평하게 놓이지 않는 더 큰 세포 또는 세포의 경우 50개 이상의 단계가 필요할 수 있습니다. 충분한 단계를 포함하고 샘플이 위와 아래에 완전히 흐려지도록 합니다.- 현미경과 관련된 소프트웨어를 사용하여 현미경을 제어합니다(재료 표참조).
- 현미경 초점 바퀴를 사용하여 세포의 중간에 초점. ND 획득에서 Z-스택을 수행하려면 Z 상자를 선택합니다. 홈 버튼을 클릭하여 셀의 중간을 시작점으로 설정합니다. 단계 크기를 0.1 μm로 설정하고 범위를 4 μm로 설정합니다.
- Lambda 창 아래에 형광 채널을 이미지화중인 형광 분자의 설정으로 설정합니다. 본 실험에서 GFP 및 mCherry를 사용하였다.
참고: 추가 형광 채널의 3D 분포가 필요한 경우 두 번째 색상 채널에서 동일한 단계 크기 및 범위로 추가 z-스택을 취합니다. 본 실험에서, 세포질 mCherry는 세포 형상을 결정하는 데 사용되었고 MreB-GFP는 제2 컬러채널(21)으로서사용하였다. - 실험 순서가 람다(z 계열)로 설정되어 있는지 확인하여 전환하기 전에 각 색상 채널에서 완전한 z 스택을 사용합니다.
- 지금 실행을 클릭하여 이미지 수집을 시작하고 파일 하나 또는 두 z 스택이 모두 완료된 파일을 저장합니다.
- 패드의 새 영역으로 이동하고 4.2.2-4.2.5 단계를 반복합니다.
5. 세포 재건
- 개별 셀을 자르고 이미지를 누적 된 tiff 파일로 저장하여 파일당 셀이 하나만 되도록 합니다. 이 셀이 다른 셀과 잘 분리되어 있는지 확인합니다(즉, xy의 흐림 기능의 전체 너비 절반 최대의 약 5배)
참고: 자유롭게 사용할 수 있는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다(재료 표참조).- 개별 셀 주위에 상자를 그리고 각 채널에 대해 한 번씩 해당 셀을 2x 복제합니다. 중복 하이퍼스택 상자를 선택했는지 확인하고 채널을 1 또는 2로 변경하여 슬라이스에 전체 z 스택이 포함되어 있는지 확인합니다.
참고: 추가형광단백질이 아닌 세포의 형상만을 이미징하는 경우, 하나의 채널만 존재하게 된다. - 두 스택을 모두 사용할 수 있게 되면 이미지로 이동 | 스택 | 도구 | 이미지를 단백질 채널과 먼저 결합하고 두 번째 형상 채널을 결합합니다.
- 새 이미지를 tiff 파일로 저장합니다.
- 개별 셀 주위에 상자를 그리고 각 채널에 대해 한 번씩 해당 셀을 2x 복제합니다. 중복 하이퍼스택 상자를 선택했는지 확인하고 채널을 1 또는 2로 변경하여 슬라이스에 전체 z 스택이 포함되어 있는지 확인합니다.
- 침하 제한된 형광비드(22)를사용하여 현미경의 흐림 기능을 측정한다. 이것은 각 현미경 및 현미경 목적을 위해 행해질 필요가 있습니다 그러나 관심있는 견본을 화상 진찰 의 앞에 또는 후에 수행될 수 있습니다.
- 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 일부 수동 개입을 사용하여 여러 개의 독립 구슬을 함께 평균합니다(재료 표참조).
참고: 최종 제품은 관심 있는 샘플과 동일한 xyz 간격을 가진 흐림 기능의 3D 이미지여야 합니다.
- 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 일부 수동 개입을 사용하여 여러 개의 독립 구슬을 함께 평균합니다(재료 표참조).
- 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 정방향 컨볼루션 셀 모양 재구성 스크립트를 실행합니다. 이러한 스크립트의 최신 버전은 https://github.com/PrincetonUniversity/shae-cellshape-public 자유롭게 다운로드 할 수 있습니다.
- 셰이 셀 셰이프-public/exampleData_tri에서 자른 이미지와 cell_shape_settings_tri.txt 파일이 포함된 바탕 화면의 폴더 안에 폴더를 만듭니다.
- 관심 실험에 대한 올바른 설정을 갖도록 cell_shape_setting_tri.txt를 편집합니다. 이 실험의 경우 설정 파일에는 다음 줄이 포함됩니다.
nm_per_픽셀 70
Z_scale 0.65
스택_z_크기 41
스택_t_크기 1
Fstack_z_크기 41
Fstack_t_크기 1
스택_seperation_nm 100
Fstack_seperation_nm 100
psfScript -999 osuPSF20180726
그라데이션 1
참고: 이 텍스트 파일은 섹션으로 구성되며 각 섹션은 자체 변수로 구문 분석됩니다. 많은 설정이 실험에서 실험으로 변경될 필요는 없지만 z-스택(모양의경우 stack_z_size, 관심 단백질의 경우 Fstack_z_size), z 스택의 간격(stack_seperation_)의 크기가 있는지 확인해야 합니다. nm, Fstack_seperation_nm,현미경의 상대 초점 이동(Z_scale)23,xy(nm_per_pixel)의픽셀 크기, 현미경의 흐림 기능을 로드하는 스크립트의 이름(psfScript )을 일치시다. 형상 채널이 세포질적으로 채워진 경우 그라데이션 필드는 1로 설정하고 멤브레인 스테인드 오브젝트인 경우 0으로 설정해야 합니다. - Cell_shape_detector3dConvTriFolder 함수(shae-cellshape-public/CellShapeDetectorTri/)를 폴더 위치로 실행한 다음 시작할 셀 수와 실행하려는 셀 수를 실행합니다.
참고: 입력에 대한 예는 다음과 같습니다 셀_shape_detector3dConvTriFolder ('잘린 이미지와 폴더경로', 폴더인덱스 시작, 셀의 #). 일반적인 세포는 재구성이 수렴되고 완료되는 데 5-20 분 이 걸릴 수 있습니다.
- 모든 통계 분석을 위해 세포를 사용하기 전에 세포 재구성이 올바른지 확인하기 위해 세포 재구성을 선별합니다.
- ScreenFits(쉐셀셰이프-퍼블릭/쉐-fitViewerGui/)를 실행하여 개별 세포 재구성을 시각적으로 검사합니다.
- 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)가 열리면 폴더 선택 버튼을 클릭한 다음 5.3단계에서 작성된 재구성 데이터 파일(TRI.mat)이 있는 폴더를 선택합니다.
- 셀의 모양이 잘못되었거나 완전히 수렴되지 않은 경우 셀 재구성 옆의 상자를 선택합니다(그림3). 이것은 구멍이있는 셀, 평평한 면 또는 분기가 나오는 것처럼 보일 수 있습니다. 이렇게 하면 파일 이름에'FLAG''가 추가되므로 다운스트림 분석에서 제외될 수 있습니다.
참고: 재구성된 셀은 원본 이미지와 비교할 수 있습니다. 이것은 당신의 세포가 모양의 다양한 이기종 인구에서 오는 경우에 특히 중요 할 수 있습니다.
- 농축스무디스플래라인(쉐-셀셰이프-퍼블릭/)을 실행하여 표면에 있는 가우시안 곡률의 함수로서 관심 있는 단백질의 상대적 농도의 농축 프로파일을 생성합니다.
- 5.3.3단계에서 작성된 TRI.mat 파일이 있는 각 폴더를 선택합니다.
- 새로 작성된(5.5.1) 곡선.mat 파일을 선택합니다.
참고: 5.5.1에서 선택한 각 폴더에 대해 curve.mat 파일이 작성됩니다. 모든 보강 프로필은 하나의 그래프에 표시됩니다. 각 폴더에 대해 5.5를 실행하는 것보다 개별 그래프가 필요한 경우.
참고: 형광 단백질의 정확한 기하학적 국소화 외에도, 개체의 수, 크기 및 방향을 계수하는 것을 포함하여 보조 채널로부터 데이터를 분석하는 많은 다른 방법이있다 4.
Representative Results
박테리아는 자연에서 자신의 기능을 결정할 수있는 모양과 크기의 다양한 에 와서1. 이 절차의 결과는 z-스택 이미지의 전방 컨볼루션으로부터 세포의 정확한 3D 표현이다(그림1). 이 방법은 2D 표현이 세포의 곡률을 정확하게 반영하지 않기 때문에 곡선세포(그림 2)또는 비정상적으로 모양의 세포(도4A)를다룰 때 특히 중요합니다. 순방향 컨볼루션 방법(그림1A)을사용하려면 세포가 주변에 염색되거나 세포질 얼룩이 있어야 합니다(그림2B 왼쪽 대 오른쪽).
도 4는 셀에서 MreB 지역화를 나타낸다. GFP 융합은 야생형 및 돌연변이 대장균 세포 모두에서 정확한 국소화를 연구하기 위해 세균 액틴 단백질 MreB21에 만들어졌다4. MreB는 막과 연관되기 때문에, 3D 화상 진찰은 세포에 있는 그것의 위치를 충실하게 재현하기 위하여 요구됩니다. 이러한 측정을 3D로 함으로써 야생형 및 rodZ 돌연변이세포(도 4A)의모양을 재구성할 수 있었습니다. MreB의 국소화는 RodZ 의존적 방식으로 3D로만 측정할 수 있는 기하학적 특징인 작은 가우시안 곡률에서 농축되는 것으로나타났다(도 4B).
그림 1: 정방향 컨볼루션 방법은 셀 모양에 대한 사전 지식 없이 셀을 재구성합니다. (A)이 방법의 최종 출력은 현미경의 보정된 흐림 기능과 시험 모양을 비교하여 유도된 3D 세포 재구성이다. 이는 관찰된 3D 이미지가 가상의 이미지와 일치할 때까지 관찰된 z-stack과 비교됩니다. 여기에 표시된 이미지는 하나의 C. 초승달 셀의 재구성 렌더링입니다. (B)재구성 파이프라인은 관찰된 이미지 스택을 기반으로 표면 요소의 예상 위치를 반복적으로 업데이트합니다. 메서드의 전체 알고리즘 세부 정보는 Nguyen3을참조하십시오. (C)재구성 파이프라인은 셀의 모양에 대한 사전 지식 없이 시작하여 관찰된 z 스택과 일치하도록 표면 정점의 위치와 수를 업데이트합니다. 3D 재건 동안 30단계마다 의 대표적인 이미지는 V. 콜레라 세포의 세 가지 다른 각도에서 나타난다. 시뮬레이션된 스택과 관찰된 스택 간의 차이를 최소화하기 위해 이 셰이프의 표면 위치가 업데이트됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 3개의 다른 모양의 세균 종의 대표적인 3D 재건. 3차원 재건은 막이 얼룩진 세포(왼쪽)로 만들거나 세포질 형광부(오른쪽)로 채워질 수 있습니다. 구부러진 막대, 꼬인 막대 또는 직선 막대가 모두 정확하게 재구성 될 수 있기 때문에 시작 셀의 모양과 곡률은 중요하지 않습니다. 재구성된 표면은 표면의 로컬 가우시안 곡률을 기반으로 색상이 지정됩니다. 배율 표시줄 = 1 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 재구성은 여러 가지 이유로 실패할 수 있습니다. 재구성 알고리즘이 적절한 결과로 수렴되도록 셀을 스크리마해야 합니다. 왼쪽 = 대표적인 야생형(상부) 및 rodZ 돌연변이체(아래) 대장균 세포가 품질 관리를 통과하였다. 오른쪽 = 제대로 재구성하지 못하고 품질 관리를 통과하지 못한 셀입니다. 실패한 수렴의 다섯 클래스가 표시됩니다: (i) 날카로운 경계로 이어지는 자르기 영역의 가장자리에 너무 가까운 셀, (ii) 다른 셀에 너무 가까운 셀, (iii) 디봇을 생성한 셀, (iv) 초기 s를 지나가지 않은 셀 (v) 기타 알 수 없는 오류가 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 특정 세포 기하학에 대한 단백질 국소화를 보여주는 대표적인 데이터. (a)야생형 및 rodZ 대장균 세포의 3차원 재구성 세포와 가우시안 곡률 및 MreB 형광 강도가 표시되어 있다. 스케일 바 = 1 μm.(B)야생 형 및 rodZ 대장균 세포로부터 MreB의 농축 플롯. 값 >1은 세포의 균일한 커버리지에 비해 이들 세포 영역에서 MreB의 고갈을 나타내고, 값 & 1은 농축 및 값 & lt;1을 보여준다. 그늘진 영역은 평균 ±90% 부트스트랩 신뢰 구간을 평균으로 나타냅니다. 각 변형률의 곡선은 입방 스무딩 스프라인이며 p > 5 x10-3의극단적인 곡률에 대한 확률 임계값을 사용하여 잘립니다. 이 그림은 (브래튼 외)에서 수정되었습니다. 4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜의 중요한 단계는 고품질 이미지를 획득하는 것입니다. 세포를 올바르게 재구성하려면 셀 위와 아래에 충분한 블러가 있어야합니다. 따라서 촬영 된 z-stack이 충분히 큰 거리를 커버하는 것이 필수적입니다. 이미지 수집 중에 수행된 단계 수를 각 변형에 맞게 조정할 수 있습니다. 예를 들어, rodZ에 대해 삭제된 대장균 세포는 더 넓고, 따라서 야생형 세포보다 더 많은 단계가 필요하며, 따라서 더 먼 거리가 필요하다. 이미지 수집 중에 샘플이 드리프트되면 재구성에 큰 오류가 있을 수 있습니다. 따라서, z-stack 획득 동안 드리프트를 피하기 위해 이미징 전에 현미경과 열 평형에 슬라이드를 두는 것이 중요하다. 세포는 낮은 자동 형광이있는 패드에서 이미지화되어야합니다. 일반적인 LB 배지에서 발견되는 것과 같은 미디어 구성 요소에는 세포를 재구성하려고 할 때 문제를 일으킬 수 있는 자가형광이 있습니다. 재구성 과정은 각 세포에 독립적으로 수행되므로 이미징 패드의 세포 밀도가 중요합니다. 너무 적은 세포는 세포의 충분한 수의 심상을 얻기 위하여 필요로 하는 시간을 증가할 것입니다, 너무 많은 세포는 개별 적인 세포를 쉽게 자르기 위하여 너무 조밀한 화상 진찰 필드 귀착될 것입니다 동안. 모든 셀이 제대로 재구성되지는 않으므로 수집 단계에서 추가 셀을 이미지화해야 하며 통계 분석을 진행하기 전에 모든 출력을 스크리브해야합니다(그림 3).
이 방법의 많은 제한 사항은 기술적입니다. 사용되는 현미경에서 박테리아의 크기 척도에서 광학 절편을 가능하게하기 때문에 높은 수치 조리개 (일반적으로 >1.4)를 가진 목표가 있어야합니다. 또한 현미경은 z 방향으로 작고 정확한 단계를 취할 수있는 압전 단계를 장착해야합니다. 또한, 필요하지는 않지만, 셀을 재구성하는 처리 시간을 단축하기 때문에 이미지 분석 소프트웨어를 실행하기 위해 높은 처리량의 계산 리소스에 액세스하는 것이 좋습니다.
이 방법의 한 가지 개념적 한계는 이미지의 신호 대 잡음 비에 비해 재구성의 부드러움에 가중치를 가중하기 위한 올바른 에너지 스케일을 선택해야 한다는 것입니다. 매개 변수의 선택을 확인하려면, 세포의 크기와 모양은 전송 전자 현미경 (TEM) 또는 원자력 현미경 검사법 (AFM)와 같은 독립적 인 방법을 사용하여 측정되어야한다. 원리의 증거로, 세포의 3D 재구성은 z-정확도(&50 nm) 또는 Xy 정확도(&30 nm)3을테스트하기 위해 TEM 그리드에서 테스트하기 위해 AFM에서 수행되었습니다. 이러한 상관 관계 접근 방식은 시간과 비용이 많이 듭니다. 더 간단한 접근법은 야생형 세포 또는 1 μm 구형 구슬과 같은 표준 샘플을 이미지화하는 것일 수 있다. 재구성의 지름과 구도는 재구성에 사용되는 크기와 에너지 스케일이 올바른지 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
이것은 형광 현미경 심상에서 고해상도 공간 정보를 추출하는 것을 추구하는 유일한 방법이 아닙니다. 많은 리뷰 기사는 초고해상도 현미경 검사법24,25의 분야에서 최근의 발전을 설명합니다. 분해 현미경검사법 (26),회전 디스크 공초점 현미경 검사법27,픽셀 재할당28및 구조화 조명 현미경 검사법 (SIM)29와 같은 해상도 향상 기술은 해상도를 개선하기 위해 노력합니다. 현미경에 의해 취득 된 이미지. 이러한 메서드는 제시된 접근 방식과 호환되지 않습니다. 최근에이 방법은 입력9로SIM 기반 이미지를 허용하도록 조정되었습니다 . 전진 컨볼루션 방법은 그 기초의 일부를 데콘볼루션 현미경 검사법과 공유하지만, 완전히 다른 출력을 가지고 있습니다. 데콘볼루션 현미경 검사법과 같은 접근법은 이미지의 해상도를 개선하기 위해 노력하는 반면, 이 접근법은 이미지를 생성하지 않고 약 50 nm정밀의 세포 형상 재구성을 생성합니다. 드물게 표지된 샘플에 기초한 단일 분자 활성 제어 현미경 기술은 이 방법보다 더 높은 수준의 공간 정밀도를 제공할 수 있습니다. 많은 경우에, 이 단 하나 분자 접근은 형광 구조물의 최적화를 요구하고 살아있는 또는 동적 견본으로 사용하기 어렵게 하는 긴 취득 시간을 요구할 수 있습니다. 이러한 각 메서드에는 이 메서드가 사용하지 않는 하나 이상의 주의 사항이 함께 제공됩니다. 예를 들면, 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의해 광고되는 이득은 비행기 빛에서 많지 않은 세균성 세포의 단층에게 적용되지 않습니다. 또한, 이 방법은 어떤 특수한 형광단의 필요 없이 정확한 3D 세포 모양 및 단백질 현지화를 취득하는 파이프라인을 제공합니다. 이 방법은 최소한의 하드웨어 요구 사항 (즉, z 압전, 높은 NA 목표)을 가지고 있으며 동적 3D 구조6을쉽게 조사 할 수 있도록 타임 포인트 당 수십 개의 이미지만 필요합니다.
3D 구조물에 있는 세균성 세포의 조직을 공부하는 접근의 증가수가 있었습니다. 이들은 고품질, 3D 형광 이미지30,31,32를활용하는 개념적으로 유사한 접근법을 포함한다. 이 접근은 잘 단리된 세포를 요구하고 셀방식기하에 관하여 더 선행 가정을 하지 않습니다. 그러나, 조밀한 세포 응집체 또는 생물막으로 이동하기 위하여, 세포는 막대 같이 가정됩니다. 이 더 낮은 해상도 보기는 생물막에 있는 세포의 고밀도가 특정 요인의 세포 외 현지화의 분석을 방지하더라도, 아직도 세포의 포장 배열을 조사할 수 있습니다.
미래에는 단일 분자및 광시야 접근법을 이 3D 재구성 기법과 통합하는 프레임워크를 개발하는 것이 흥미로울 수 있습니다. 더욱이, 보다 조밀한 세포 클러스터의 재구성을 허용하기 위해 머신 비전 세분화도구(32)를 사용하여 이러한 전방 컨볼루션 접근법을 포함할 수 있다.
세포가 특정 모양으로 진화한 이유는 세포가 살고 있는 복잡한 환경을 반영해야 하는 복잡한 문제입니다. 세포 모양의 진화와 기능을 이해하려면 이러한 모양을 정확하고 정확하게 측정해야 하며, 이 측정은 이 방법이 제공하는 것입니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 방법을 개발해 주신 제프리 응우옌과 조슈아 샤비츠에게 감사드립니다.
자금: RMM - NIH F32 GM103290-01A1, BPB - 노화 연구 및 국립 과학 재단 PHY-1734030을 위한 글렌 센터.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 nm fluorescent beads | Invitrogen | F8795 | these are used to measure the blurring function of the microscope |
| Agarose | sigma-Aldrich | A9539 | |
| Cotton Swab | Puritan Medical Products Company LLC | S304659 | used to appy VaLaP |
| Cover Slips | VWR | 16004-302 | |
| Fiji | ImageJ | https://fiji.sc | used to cro cells |
| FM4-64 | Invitrogen | LST3166 | membrane dye used to stain cells |
| Huygens Software | Scientific Volume Imaging | Huygens essential or professional | Use to measure blurring function of microscope |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | combine with paraffin and petroleum jelly to make VaLaP |
| LB growth medium | BD Difco | DF0446173 | |
| M63 medium | US Biological | M1015 | |
| MATLAB | Mathworks | Needed to run forward convolution scripts | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-133 | |
| NIS Elements | Nkon | ||
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327212 | |
| Petroleum Jelly | Equate | 49035-038-27 | |
| Piezo z stage | Nikon | 77011589 | |
| Pipet tips -p200 | USA Scientific | 1111-0730 | |
| Pipet tips- p10 | USA Scientific | 1111-3730 |
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