Ratte Mammary Epithel Cell Transplantation in das interskapulierische weiße Fettpad
Summary
Dieser Artikel beschreibt eine Transplantationsmethode, um Spenderratten-Epithelzellen in das interskapulierliche weiße Fettpolster von Empfängertieren zu transplantieren. Diese Methode kann verwendet werden, um wirtliche und/oder Spendereffekte auf die Entwicklung von Brustepithel zu untersuchen und eliminiert die Notwendigkeit einer Vorabklärung, wodurch die Nützlichkeit dieser Technik erweitert wird.
Abstract
Bereits in den 1970er Jahren haben Forscher erfolgreich Epithelzellen der Brust in das interscapuläre weiße Fettpolster von Ratten transplantiert. Das Grafting-Mammaepithel mit Transplantationstechniken nutzt die hormonelle Umgebung des jugendlichen Nagetierwirts. Diese Studien sind ideal geeignet, um die Auswirkungen verschiedener biologischer Manipulationen auf die Entwicklung der Brustdrüse zu untersuchen und viele Aspekte der Brustdrüsenbiologie zu sezieren. Ein häufiges, aber einschränkendes Merkmal ist, dass transplantierte Epithelzellen stark von der umgebenden Stroma beeinflusst und durch endogenes Epithel übertroffen werden; Um natives Brustgewebe zu nutzen, muss das abdominale weiße Fettpolster vor der Transplantation gelöscht werden, um das Brustepithel zu entfernen. Ein großes Hindernis bei der Verwendung des Rattenmodellorganismus ist, dass die Beseitigung des sich entwickelnden Brustbaums bei nachentwöhnten Ratten nicht effizient ist. Bei der Transplantation in drüsenfreie Fettpolster können Spenderepithelzellen das gelöschte Wirtsfettpad wieder bevölkern und eine funktionelle Brustdrüse bilden. Das interskapulierliche Fettpolster ist ein alternativer Ort für diese Transplantate. Ein großer Vorteil ist, dass es an duktalen Strukturen fehlt, aber die normale Stroma liefert, die notwendig ist, um epitheliale Auswüchse zu fördern und in der Ratte leicht zugänglich ist. Ein weiterer großer Vorteil dieser Technik ist, dass sie minimal invasiv ist, weil sie die Notwendigkeit eliminiert, den wachsenden endogene Brustbaum zu kauterisieren und zu entfernen. Darüber hinaus enthält das interskapulierliche Fettpad ein mediales Blutgefäß, das verwendet werden kann, um Standorte für die Transplantation zu trennen. Da die endogenen Drüsen intakt bleiben, kann diese Technik auch für Studien verwendet werden, die die endogene Brustdrüse mit der transplantierten Drüse vergleichen. Dieses Papier beschreibt die Methode der Brustepithelzelltransplantation in das interscapuläre weiße Fettpolster von Ratten.
Introduction
Postnatale Brustdrüsenentwicklung und duktale Morphogenese sind Prozesse, die weitgehend durch hormonelle Signalisierung zu Beginn der Pubertät beeinflusst werden. Bei Mäusen und Ratten, häufig verwendeten Modellorganismen der Brustdrüsenbiologie, beginnt dieser Prozess etwa 3 Wochen im Alter, wo eine schnelle Proliferation und Differenzierung zur Bildung des reifen Parenchyms führen. Die reife Brustdrüse kann zahlreiche Expansions- und Involutionrunden durchlaufen, eine Eigenschaft, die seit dem frühen20. Jahrhundert untersucht wird. Im Rahmen der Hyperproliferation und der Krebsentwicklung wurden in den 1950er Jahren1Brustdrüsentransplantationstechniken entwickelt und durch die quantitative Methodik verbessert, die Gould et al. 1977 2,3,4beigesteuert haben. Die Verfeinerung der Transplantationstechnik bei Nagetieren hat zu großen Fortschritten beim Verständnis der normalen Brustdrüsenbiologie beigetragen, die immer noch weit verbreitet sind, um die Wirkung verschiedener Behandlungen und genetischer Manipulationen auf normale Brustdrüsenentwicklung und Krankheitszustände zu untersuchen.
Viele Hypothesen wurden erstellt und anschließend mit Brustdrüsentransplantation getestet, zuerst beschrieben von DeOme et al. 19591. Experimente über mehrere Jahrzehnte zeigten die Neigung des duktalen Gewebes, das aus den Spender-Brustdrüsen entnommen wird, um das gesamte Fettpolster5,6,7 wieder zu bevölkern, und zeigten, dass eine kritische Komponente der Entwicklung der Brustdrüse in diesen epithelialer Strukturen liegt. Spätere Studien an Mäusen zeigten, dass eine einzelne Bruststammzelle ein gelöschtes Fettpolster wieder bevölkern kann und zur Entdeckung eines einzigen, gemeinsamen Vorläufers von Basal- und Luminal-Mammaepithelzellen8,9,10beigetragen hat. Im Einklang mit diesen Schlussfolgerungen, Es wurde vorgeschlagen, dass Transplantation erhöht den Pool von Zellen mit Multilineage-Wiederbevölkerung Potenzial als Folge der Plastizität, so dass die transplantierten Zellen eine funktionelle Brustdrüsewachsen 7,10,11,12,13. Wichtig ist, dass der Einsatz von Transplantationstechniken bei Nagetieren die Grenzen von zellkulturinduzierten Anomalien14 überwindet und oft in nur wenigen Wochen Ergebnisse liefert.
Während das Verfahren ursprünglich im Zusammenhang mit präneoplastischen Läsionen bei Mäusen beschrieben wurde, wurde es bald auf Ratten ausgeweitet und in Verbindung mit der karzinogenen Behandlung verwendet, um die Multiplizität als Maß für die Krebsanfälligkeit zu etablieren15, aber die Popularität von Transplantationstechniken hat die Entwicklung genetischer Werkzeuge für jede Art verfolgt. Obwohl Mausstudien mit Transplantation viele translationale Befunde beigesteuert haben, ähnelt das Parenchym der Rattenbrustdrüse dem Menschen näher16,17 und bietet deutliche Vorteile für die Untersuchung von Östrogenrezeptor-positivem (ER+) Brustkrebs. Brusttumoren sind in beiden Arten induzierbar, unterscheiden sich jedoch in Bezug auf Hormonempfindlichkeit und Genexpressionsprofile. Ein primärer Unterschied ist, dass Rattenbrusttumoren ausdrücken und von der Funktion der Eierstock- und Hypophysenhormonrezeptoren abhängen, nämlich Östrogen und Progesteron (PR), ähnlich dem Luminal-A-Subtyp des menschlichen Brustkrebses. Tatsächlich wurde die Transplantation von Epithelzellen, wie in diesem Protokoll beschrieben, verwendet, um genetische Varianten zu untersuchen, die an Brustkrebs beteiligt sind, und die zelluläre Autonomie der Wirkungen auf Dieepithelzellen18zu bestimmen.
Neben der Tumorbiologie weist das duktale Epithel der normalen Rattenbrustdrüse eine höhere Verzweigung auf und wird von einer dickeren Stromaschicht flankiert als die Maus. Die Bedeutung der Stroma ist in Brustepitheltransplantationsstudien gut dokumentiert. Das Brustepithel muss mit fettem Stroma und idealerweise seinem eigenen Mesenchym interagieren, um seine charakteristische Morphogenese19,20zu durchlaufen. Das Verpflanzen von Gewebe in eine Empfänger-Brustdrüse bietet eine optimale Umgebung; das Vorhandensein von endogenem Epithel kann jedoch die Ergebnisse beeinträchtigen. Die Vorreinigung der Brustdrüse von endogenem Epithel wird häufig in Maustransplantationstests durchgeführt und erfordert eine chirurgische Exzision des endogenen Brustgewebes und/oder die Entfernung der Brustwarze1,21,22. Obwohl möglich, ist die Vorreinigung des Brustepithels bei nach entwöhnenden Ratten nicht so weit verbreitet, vor allem aufgrund der Unwirksamkeit der Räumung des wachsenden Brustbaums bei nach entwöhnenden Ratten. Da gezeigt wurde, dass Regionen von Fettgewebe an anderer Stelle im Körper das Wachstum des transplantierten Brustepithels21,23,24unterstützen könnten, kann der Prozess der Vorräumung bei Ratten leicht vermieden werden, indem Gewebe in das interscapuläre weiße Fettpolster transplantiert wird.
Die in diesem Papier beschriebene Transplantationsmethode beinhaltet die Injektion von enzymatisch dissoziierten Brustdrüsenorganoiden (Fragmente von Brustduktalepithel und anderen Zelltypen, die morphogenestisch geeignet sind) oder monodispergierten Zellen in das interscapuläre Fettpolster in inzucht, isogenen oder kongenen Stämmen von Laborratten2. Da das interskapuläre Fettpolster normalerweise frei von Brustgewebe ist, bietet es eine geeignete Umgebung für mehrere Transplantationsstellen, ohne dass endogenes Epithel vorgeklärt werden muss. Infolgedessen sind die endogenen, abdominalen Bauch-Leisten-Brustdrüsen des Wirtstiers keiner chirurgischen Manipulation ausgesetzt, entwickeln sich normal und können die Interpretation der Ergebnisse nicht beeinträchtigen. Zusätzlich können die intakten Brustdrüsen zum Vergleich verwendet werden, um Wirts- und Spendereffekte auf die Entwicklung des Brustepithels und die Tumorgenese18,25zu bewerten. Obwohl die Repopulation der Brustdrüse aus einer einzigen Stammzelle für Mäuse verfügbar ist, wurde sie noch nicht für Ratten entwickelt, hauptsächlich aufgrund der fehlenden Verfügbarkeit von Antikörpern zur Auswahl für Bruststammzellen der Ratte25,26,27. Trotzdem kann die Transplantation von monodispersen Epithelzellen der Brust zur Quantifizierung des Wiedervolksungspotenzials erfolgreich durchgeführt werden, und diese Zellen entwickeln sich normal, wenn sie in das entsprechende Gerüst eingepfropft werden2,3,4. Während Organoide für viele Zwecke gut sind, sind monodisperse Zellen für quantitative Anwendungen erforderlich, um beispielsweise die Anzahl der Brustepithelzellen zu bestimmen, die für die Krebsinitiierung nach ionisierender Strahlenbehandlung28 oder zum Vergleich der Merkmale der zytometrischen Zytometrie-Epithelzellpopulationen benötigt werden29.
Bis heute ist das hier beschriebene Verfahren die robusteste Methode zur Durchführung von Brustdrüsentransplantationen bei ratten mit dem übergeordneten Ziel, die Entwicklung der Brustdrüse und die Mechanismen, die der Entwicklung von Brustkrebs zugrunde liegen, zu untersuchen. Häufig sind spender- und/oder Empfängertiere vor, während oder nach der Epitheltransplantation unterschiedlichen Variablen ausgesetzt. Beispiele sind einzelne Genstudien mit chemischer Karzinogenese30, Strahlung28,31,32, genetische Manipulation des Wirts-/Spendergenoms18und hormonelle Manipulation12. Ein großer Vorteil der in diesem Protokoll beschriebenen enzymatischen Dissoziation ist die Möglichkeit, epitheliale Organoide oder monodisperse Zellen für komplementäre Experimente mit Durchflusszytometrie, 3D-Kultur, Genbearbeitung und mehr zu isolieren. Zukünftige Anwendungen dieser Technik werden zusätzliche Manipulationen von Spender- und/oder Wirtsgewebe mit Gentechnik umfassen. Beispielsweise können Spenderzellen ex vivo an jedem ausgewählten genomischen Ort mit dem CRISPR-Cas9-Genbearbeitungssystem genetisch verändert werden. In ähnlicher Weise können Empfängerratten auch genetisch verändert werden, um die Wechselwirkung zwischen spender- und empfängertechnischen genetischen Faktoren zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine Brustepithelzelltransplantationstechnik, die für die Arbeit mit Ratten optimiert ist. Isolierte Epithelorganoide von Spenderratten (3-5 Wochen alt) werden in das interskapulierliche weiße Fettpolster der Empfängerratten (ebenfalls 3-5 Wochen alt) eingepfropft. Die Ergebnisse können nur 4-6 Wochen später interpretiert werden, mit Hilfe der Lichtmikroskopie, um das transplantierte Gewebe zu untersuchen; Allerdings muss vor der Durchführung eines vollständigen Experiments die optimale…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den Forschungsfinanzierungsmittel des Hollings Cancer Center es Cancer Center Support P30 CA138313 von den National Institutes of Health (https://www.nih.gov/) und Mittel des Department of Pathology & Laboratory Medicine der Medical University of South Carolina finanziert. Wir danken Marijne Smiths für die Aufzeichnung der Interview-Aussagen.
Materials
| 0.2 µM syringe filters | Fisher Scientific | 09-715G | sterile-filtering collagenase digestion media |
| 1.5 – 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 05-408-129 | containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture |
| 100 µM cell strainers | Corning | 431752 | filtering brain homogenate |
| 100 uL gastight syringes with 25 gauge needles | Hamilton | 81001 & 90525 | For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition) |
| 1000 uL pipette tips + pipette | – | – | transferring cells/mixtures/tissue |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon (Corning) | 352196 | brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation |
| 40 µM cell strainers | Corning | 431750 | filtering organoids after washing the cell pellet |
| 50 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | for collagenase digestion of donor mammary gland tissue |
| 60 mm dishes | Thermo Scientific | 130181 | for mincing tissue |
| Alum Potassium Sulfate | Sigma-Aldrich | 243361/237086 | staining mammary gland whole mount slides |
| Anesthesia vaporizer for veterinary use | – | – | follow institutional protocol |
| Beta-dine or iodine | – | – | |
| Borosilicate glass culture tube for homogenization | Fisher Scientific | 14-961-26 | for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer) |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C6152/1022 | staining mammary gland whole mount slides |
| Cell counting apparatus | – | – | |
| Clean animal cages for recovery | – | – | follow institutional protocol |
| Collagenase Type 3 | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats |
| deionized water | – | – | for chemical solutions |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320033 | for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures |
| EDTA | – | – | monodispersion mixture |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2705/2701 | mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | – | inactivation solution |
| Gauze | – | – | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol) |
| HBSS | GIBCO | – | monodispersion mixture |
| Heating pads | – | – | follow institutional protocol |
| Ice buckets (x2) | – | – | |
| Incubator with orbital rotation | – | – | must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue) |
| Isoflurane anesthesia | – | – | follow institutional protocol |
| Light microscope or digital camera | – | – | visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images |
| Mechanical homogenizer | Fisher Scientific | – | TissueMiser or alternative models |
| Mineral oil, pure | Sigma-Aldrich/ ACROS Organics | 8042-47-5 | long-term storage of cleared mammary gland whole mounts |
| Oxygen tanks for anesthesia vaporizer | – | – | follow institutional protocol |
| Paper towels or delicate task wipes | – | – | |
| Positively-charged microscope slides | Thermo Scientific | P4981-001 | mammary gland tissue whole mounts |
| Postoperative analgesic | – | – | Institutional protocol |
| Scale | body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication | ||
| Shaver | – | – | electric clippers, or other |
| Staining jars | – | – | minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred |
| Sterile field drapes | IMCO | 4410-IMC | used during transplantation |
| Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved) | – | – | autoclave surgical tools used for donors and recipients |
| Syringes: 5 mL (or greater) | – | – | for sterile filtration of collagenase digestion media |
| Trypsin | Worthington | monodispersion mixture | |
| Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated) | – | – | |
| Wound clip applier, clips, and removal tool | Fine Science Tools | 12020-00 | Closing the skin incision over the interscapular white pad pad |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | clearing mammary gland whole mount slides after staining |
References
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