Summary
提出的协议使用流细胞测定来量化培养小鼠肠细胞中的增殖和死细胞数量。该方法有助于评价药物治疗对器官增殖和存活的影响。
Abstract
肠道上皮作为屏障，阻止光质成分，如致病微生物群和毒素，进入身体的其余部分。上皮屏障功能需要肠道上皮细胞的完整性。上皮细胞增殖维持一个连续的细胞层，形成屏障，上皮损伤导致屏障功能障碍。因此，发光物可以通过不受限制的路径穿过肠道屏障。肠道屏障功能障碍与许多肠道疾病有关，如炎症性肠病。分离的小鼠肠道墓穴可以培养和维持为隐晦状结构，称为肠道器官或"肠状物"。肠类是研究肠道上皮细胞在体外增殖和细胞死亡的理想选择。在这个协议中，我们描述了一种简单的方法来量化培养的肠细胞中的增殖细胞和死细胞的数量。5-ethynyl-2'-脱氧尿碱（EdU）和碘化钠用于标记肠子中的增殖和死细胞，然后通过流动细胞学分析增殖和死细胞的比例。这是一个有用的工具，以测试药物治疗对肠道上皮细胞增殖和细胞生存的影响。
Introduction
肠道上皮细胞的一个基本功能是保护光细胞的进入，如致病菌和毒素1，2。为了发挥这种功能，肠道干细胞不断增殖和分化成各种上皮细胞，包括肠细胞和分泌细胞，它们通过形成紧密的连接形成屏障3。肠道上皮细胞的快速更新需要严格协调细胞增殖、细胞分化和细胞死亡4、5。细胞增殖减少或细胞过度死亡会导致上皮损伤和屏障功能受损1，6。肠道屏障功能障碍与炎症性肠病7、8有关。
以前已经开发出一种培养肠道墓穴的方法。使用这种技术，分离的小鼠密码生长成肠道器官（肠状体），具有像结构一样的隐液，并包含所有肠道上皮细胞系9，10。5-Ethynyl-2'-脱氧尿碱（EdU）是一种胸腺素模拟物，能够取代在细胞增殖过程中正在复制的DNA中的胸腺素（T）。增殖细胞可以通过EdU染色快速准确地标记。碘化钠（PI）是溴化铀的模拟，在插入双链DNA后释放红色荧光。PI 专门检测死细胞，因为它只通过受损的细胞膜。
在这个协议中，我们首先描述如何从鼠小肠中分离出墓穴，然后在体外将它们培养成肠状体。然后，我们描述了如何通过EdU和PI结合和流动细胞学分析肠细胞中的增殖细胞和死细胞。
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Protocol
该协议得到了苏科大学剑桥-苏达基因组资源中心（CAM-SU）动物护理和使用委员会的批准。
1. 肠道器官分离与培养
- 肠道墓穴和肠癌培养的分离
- 用CO2吸入8周大的野生型小鼠安乐死。使用组织钳和细虹膜剪刀解剖出约8厘米的回肠。
- 使用带有加韦奇喂养针的注射器冲洗出来，用约 40 mL 的冰冷 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 （DPBS），然后用剪刀纵向切割并打开回肠。
- 将回肠切成小块（0.5±1.0 厘米）。将碎片放入5 mL无菌冰冷的 DPBS 中，放入 15 mL 锥形管中，然后在冰上摇动 5 分钟。
- 使用移液器控制器吸出 DPBS 并将其替换为 10 mL 的冷缓冲液 1（DPBS 中的 2 mM EDTA）。冰上摇滚30分钟。
- 使用移液器控制器吸出缓冲液 1，并替换为 10 mL 的冷缓冲液 2（54.9 mM D-山梨醇，DPBS 中的 43.4 mM 蔗糖）。用手摇动 2⁄3 分钟（约 80 摇/分钟）。
- 摇动后，在显微镜下检查，取取20μL的缓冲液2内容物。
- 用70μm无菌细胞滤网过滤缓冲液2内容物，然后用50 mL锥形管收集过滤缓冲液。
- 将 20 μL 的滤液移入幻灯片以计数墓穴。从步骤 1.1.7 传输足够的缓冲区 2，以确保有 +500 个密码/井。
- 在 4°C 下以 150 x g向下旋转 10 分钟。一旦旋转完成，小心吸出上清液。
- 每500个孔底膜基质（例如，Matrigel）的50μL中悬浮墓穴，上下移液器（小心避免气泡），然后将50μL的基底膜基质/密室混合物放在24孔板中一口井的中心。在37°C下孵育30分钟，以聚合基底膜基质。
- 聚合 30 分钟后，小心添加 600 μL 的微型培养基（高级 Dulbecco 的改性鹰介质 [DMEM]/F12、2 mM L-丙氨酸-L-谷氨酰胺、笔/链球菌 [100 单位/mL]， 10 mM 海带，N2 补充剂 [1：100]，B27 补充剂 [1：50]与表皮生长因子 [EGF; 50 纳克/mL]， 诺金 [100 纳克/mL]， R-spondin [500 纳克/mL] 和 Y27632 [10 [M]） 到每口井，然后将板返回到 37°C 培养箱。每天在显微镜下观察，每2~3天更换一次。
- 肠状传递
注： 对于长培养物，肠子应大约每周进行分裂。- 要通过肠子，将组织培养板放在冰上。吸气介质，向每个井添加 1 mL 的冷 DPBS。使用 P1000 尖端上下移液，直到没有固体基底膜基块保留。
- 通过 1 mL 胰岛素注射器 （27 G） 向上和向下传递一次，并放入 15 mL 锥形管中。在 4 °C 下在 150 x g下旋转 5 分钟。
- 使用移液器卸下 DPBS。在50μL的基底膜基质/井中重新悬浮。
- 将板置于 37°C 培养箱中 30 分钟，使基底膜基质聚合。用600 μL的ENR介质覆盖每个孔（微型介质，50纳克/mL EGF，100纳克/mL诺金，500纳克/mL R-spondin），然后将板返回到培养箱。
2. 肠内EdU阳性细胞的流细胞测定分析
注：图1显示了肠内EdU阳性细胞的流细胞测定分析工作流程。
- 用 EDU 孵育肠子
- 从步骤1.2.4生长肠子5~7天。通过以1：2的分割比进入新的24井板。在每个井中加入 600 μL 的 ENR 介质。在37°C培养箱中孵育肠子4~5天。
- 设置对照组（未经处理的肠类）和实验组（用5纳克/mL白细胞介素22[IL-22]处理的肠类）。为每个组准备至少三个复制。
- 将 EDU 添加到 ENR 介质中，以制备浓度为 50 μM 的 EDU 介质。在每个井中加入600μL的EdU介质，在37°C培养箱中孵育2小时。将一口无 EdU 处理的肠子作为背景减法的负对照。
- 从基底膜基质中采集肠子
- 使用移液器控制器吸出 EdU 介质，并使用 DPBS 清洗 1x。添加 1 mL 的 DPBS。
- 使用 P1000 移液器尖端和移液器上下，直到没有固体基底膜基块保留。转移到15 mL管中，以300 x g旋转5分钟。丢弃上清液。
- 加入500μL细胞解散酶（材料表），在37°C下孵育15分钟。使用 P200 移液器尖端和移液器向上和向下将细胞分解为单个单元。
- 加入含有10%胎儿牛血清（FBS）的3 mMeM培养基，并用P1000移液器尖端反复移液器。
- 以 300 x g向下旋转 5 分钟，吸出上清介质。用 1 mL DPBS 重新悬浮细胞。
- 细胞的固定和渗透
- 将细胞悬浮液转移到1.5 mL管中，以300 x g旋转5分钟，然后丢弃上清液。
- 用1mL的4%甲醛（PFA）重新悬浮细胞，在室温（RT）下固定15分钟，在300 x g下旋转5分钟。 用移液器尖端吸气上清液，用DPBS洗涤1x，然后向下旋转以去除上清液。
- 用1mL为0.5%的非离子表面活性剂重新悬浮细胞。在 RT 孵育 10 分钟。
- 以 300 x g向下旋转 5 分钟，吸出上清液。用 DPBS 清洗 1x 并向下旋转以去除上清液。
- 检测 EDU
- 提前为每个组件准备库存解决方案：1） Alexa Fluor azide 的工作溶液，2） 1x EdU 反应缓冲液的工作溶液，以及 3） EdU 缓冲液添加剂的 10x 库存溶液。
- 通过在去离子水中稀释 1：10 溶液，制备 1x EdU 缓冲液添加剂。请新鲜准备此解决方案。
- 根据表1准备反应鸡尾酒。
注：按表中列出的顺序添加成分。在准备后15分钟内使用反应鸡尾酒。 - 将100 μL的反应鸡尾酒加入每1.5 mL管中。重新悬浮细胞，防止光线照射，在RT孵育30分钟。
- 在 300 x g下离心 5 分钟，用移液器尖端轻轻吸气反应溶液。
- 在每个管中加入0.5%的非离子表面活性剂渗透剂，在RT.离心器300 x g下清洗1x5分钟，用移液器尖端轻轻吸出上清液，并将细胞重新悬浮在1 mL的DPBS中。
- 流动细胞测定分析细胞
- 用40μm滤网过滤再悬浮的细胞，然后用15 mL锥形管收集过滤的细胞。尽快执行 FACS 机上检测。
注：如果条件有限，细胞染色样品应储存在黑暗中，温度为4°C，并在3天内进行流量测试。 - 选择适当的通道（根据 EdU 套件中的 Alexa Fluor azide 类型;此处为红色通道）和电压（此处为 +150–350 V）进行流式细胞测定分析。
- 浇注策略
- 绘制 FSC-A（x 轴）与SSC-A（y 轴）伪彩色绘图，并通过调整电压将大部分单元分布到点贴图的可见范围。选择细胞群 （R1） 并排除左下角的细胞碎片。
- 从 R1 单元群中，建立 FSC-A（x 轴）与。FSC-H（y 轴）伪色绘图，并将门设置为选择单个单元格 （R2） 以排除单元格块。
- 从 R2 细胞群中，建立荧光强度 （x 轴）与。单元格数（y 轴）绘图，并使用负控制设置门。荧光信号区域为正细胞区域（R3）。比较实验组和对照组之间EdU阳性细胞（R3）的比例。
- 用40μm滤网过滤再悬浮的细胞，然后用15 mL锥形管收集过滤的细胞。尽快执行 FACS 机上检测。
3. 肠内PI阳性细胞的流细胞测定分析
注：图2显示了肠类PI阳性细胞的流细胞测定分析工作流程。
- 用PI孵育的肠细胞
- 从步骤1.2.4生长肠子5~7天。通过以1：2的分割比进入新的24井板。在每个井中加入 600 μL 的 ENR 介质。在37°C培养箱中孵育肠子4~5天。
- 设置对照组（未经处理）和实验组（IL-22处理），对每组至少使用三个复制。
- 将 PI 添加到 ENR 介质中，以制备浓度为 3 μM 的 PI 介质。
- 向每口井中加入600μL的PI培养基，在37°C培养箱中孵育30分钟。将一口无 PI 处理的肠子作为背景减法的负对照。
- 按照步骤 2.2.1_2.2.5 从基底膜基质采集肠子。
- 流动细胞测定分析细胞
- 用40μm滤网过滤再悬浮的细胞，用15 mL锥形管收集过滤的细胞。
- 尽快执行 FACS 机上检测。
注：如果条件有限，细胞染色样品应储存在黑暗中，温度为4°C，并在3天内进行流量测试。 - 选择适当的通道（此处为红色通道）和电压（此处为 +150*350 V）进行流式细胞测定分析。
- 使用第 2.5.3 节所述的相同浇注策略。
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Representative Results
小肠墓穴在基底膜基质中分离和培养为肠状物。隔离后2天，肠小病开始形成芽。在第6天，肠子有许多芽，在流明中有很多碎片（死细胞）。在这个阶段，肠子已经准备好通过（图3）。
许多研究表明，炎症细胞因子对于维持肠道上皮平衡至关重要。炎症细胞因子的异常表达与炎症性肠病的发生密切相关11。例如，我们以前的研究表明，IL-22促进过境扩增细胞的增殖，但也耗尽Lgr5+干细胞12。
肠子用IL-22治疗3天，之后合成DNA被标记为EdU，以指示细胞增殖。IL-22处理的肠细胞显示EDU+细胞数量增加（图4A）。IL-22将增殖细胞从40.1%增加到83.5%，通过流动细胞学分析（图4B）。IL-22治疗也增加了肠细胞死亡，如PI染色（图5A所示）。IL-22将死细胞从4.9%增加到16.2%，根据流动细胞学分析（图5B）。
图1：肠内EdU阳性细胞的流细胞测定分析工作流程图。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：肠类PI阳性细胞流细胞测定分析的工作流程图。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：在2、4和6天下分离的肠子的光明场图像。刻度条 = 100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：IL-22增加肠子增殖。（A） 肠子在没有或与 IL-22 （5 ng/mL） 的介质中培养 3 天，用 EdU（红色）孵育 1 小时。（B） 流式细胞学数据来自没有（左）或（右）IL-22培养的肠子。数据代表三个独立的实验。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：IL-22促进肠细胞死亡。（A） 肠子在没有IL-22（5纳克/mL）的介质中培养3天，并沾染碘化钠（红色）。刻度条 = 100 μm。（B） 流式细胞学数据来自没有（左）或（右）IL-22培养的肠子。数据代表三个独立的实验。请点击此处查看此图的较大版本。
| 反应成分 | 24孔板的井数 | |||||
| 1 | 2 | 5 | 10 | 20 | 50 | |
| 1x 反应缓冲液 | 86 μL | 172 μL | 430 μL | 860 μL | 1.72 μL | 4.3 μL |
| CuSO4 | 4 μL | 8 μL | 20 μL | 40 μL | 80 μL | 200 μL |
| 亚历克萨·福拉·阿齐德 | 0.25 μL | 0.5 μL | 1.25 μL | 2.5 μL | 5 μL | 12.5 μL |
| 反应缓冲器添加剂 | 10 μL | 20 μL | 50 μL | 100 μL | 200 μL | 500 μL |
| 总体积 | 100 μL | 200 μL | 500 μL | 1 μL | 2 μL | 5 μL |
| 注：按表中列出的顺序添加成分。 | ||||||
表1：EdU反应鸡尾酒。
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Discussion
该协议详细说明了在体外培养肠子的必要步骤，并通过流式细胞测定对肠细胞中的EdU和PI阳性细胞进行定量。这种策略有几个优点。首先，EdU标签用于检测肠细胞中的增殖细胞。与传统的BrdU测定法相比，EdU标签方法更快、更灵敏、更准确。EdU与胸腺素（T）非常相似，在细胞分裂期间，在DNA合成中取代胸腺素。与BrdU抗体相比，EdU更容易扩散到细胞中，EdU的检测不需要DNA变性和抗原抗体反应。其次，流式细胞学分析可以快速准确地量化肠细胞中的增殖（EdU+）和死（PI+）细胞。
为了成功执行整个过程，需要考虑一些关键方面。首先，在充分条件下培养肠子是很重要的。生长良好的肠小动物应有大量的芽，其中含有增殖细胞。其次，及时分离肠子是很重要的。流明中积聚的碎片含有死细胞，可染上PI。这对下面的流式细胞学分析有害。第三，由于多个步骤（即细胞染色、细胞固定、膜破裂和离心），细胞在手术过程中很容易丢失。因此，收集足够数量的肠子是很重要的。在固定之前，必须结合 2⁄3 孔（在 24 孔板中）的肠子。最后，向缓冲器添加成分以检测 EdU 至关重要，否则反应不会以最佳状态进行。
总之，该协议详细介绍了在体外培养小鼠肠子以及通过流动细胞测定对增殖和死细胞进行量化的步骤。肠小儿是疾病建模和治疗药物发现的有用工具。该协议有助于探索炎症细胞因子、病原体和药物对肠细胞培养模型中细胞增殖和细胞存活的影响。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金（31971062、31900326、31601022）、江苏省自然科学基金（BK20190043、BK20180838）、药物生物技术国家重点实验室研究基金、江苏省自然科学基金、江苏省自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金委员会、江苏省自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金委员会、中国科学院、国家自然科学基金、国家自然科学基金委员会、江苏省自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金委员会、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学、科技攻关、科技攻关计划、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金南京大学（KF-GN-202004）。中国江苏省高等院校自然科学基金（19KJB320003）、苏州市民生与技术计划（SYS2019030）和江苏省高校毕业生研究创新计划（KYCX19-1981）.这项工作也得到了苏中大学的唐学者的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 22 G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 24-well plate | Nunc | 142475 | |
| 40 mm sterile cell strainer | BD | 352340 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 70 mm sterile cell strainer | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 Supplement | GIBCO | 17504044 | |
| Buffer 1 | 2 mM EDTA in DPBS | ||
| Buffer 2 | 54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS | ||
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Cell-dissociation enzymes (TrypLE) | Life technologies | 12605-010 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life technologies | C10639 | |
| CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-sorbitol | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR media | Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Fine Iris Scissors | Tansoole | 2037454 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | |
| Goat Serum | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut media | Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50) | ||
| N2 supplement | R&D | AR009 | |
| Nonionic surfactant (Triton X) | BBI | TB0198-500ML | |
| Operating Scissor (12.5 cm) | Tansoole | 2025785 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | sigma | 158127-500g | |
| Penn/Strep | Invitrogen | 15140-148 | |
| Phase contrast microscope | Nikon | TS1000 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170-25MG | |
| Recombinant EGF | PeproTech | 315-09 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| Recombinant Murine IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| Sucrose | BBI | SB0498 | |
| Tissue Forceps | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
References
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