热通菌膜-双磷酶抑制剂的筛选
Summary
在这里，我们提出了膜结合焦磷酶（来自热托加水红素）抑制剂的筛选方法，其依据是96孔板格式的二恶极蓝色反应。
Abstract
膜结合的焦道面酶 （mPPases） 是存在于细菌、古体、植物和原生寄生虫中的二恶酶。这些蛋白质将焦磷酸盐切成两个正磷酸盐分子，与质子和/或钠在膜上泵送结合。由于动物和人类中不存在同源性蛋白，因此，在设计潜在的药物靶点时，mPPass 是很好的候选者。在这里，我们提出了一个详细的协议，以筛选mPPase抑制剂利用在96井板系统中的三联体蓝色反应。我们使用来自热亲菌的mPPase作为模型酶。该协议简单且成本低廉，产生一致且可靠的结果。从测定开始到吸光度测量，只需大约一个小时完成活动测定协议。由于此测定中产生的蓝色长期稳定，因此后续测定可在上一批之后立即进行，并且以后可以同时测量所有批次的吸光度。该协议的缺点是，它是手动完成的，因此可能会耗尽，以及需要良好的移液和时间保持技能。此外，本测定中使用的阿森特-柠酸酯溶液含有醋酸钠，该钠有毒，应采取必要的预防措施处理。
Introduction
细胞蛋白总量的约25%是膜蛋白，其中约60%为药物靶点1、2。潜在的药物目标之一，膜结合的焦磷酸酶（mPPases），是二氧化硅酶，通过水解焦磷酸化将质子和/或钠子泵入膜，并注入两个正磷酸盐4。mPPases可以在各种生物中发现，如细菌、古生物、植物和原生寄生虫，但人类和动物4除外。在原生寄生虫中，例如恶性疟原虫、弓形虫和锥虫病，pPPases对寄生虫毒性6至关重要，在寄生虫中敲除这种表达会导致在接触外部基本pH7时无法维持细胞内pH。由于其重要性和缺乏同源蛋白存在于脊椎动物中，mPPases可被视为潜在的药物靶点，用于原原病3。
这项工作中mPPase抑制剂的体外筛选基于TmPPase模型系统。TmPPase是一种钠电泵和钾依赖mPPase从T.马里蒂马，其最佳活性在71°C8。例如，这种酶的益处是易于生产和纯化，热稳定性好，活性高。TmPPase除了完全保持位置外，还表现出高度相似性，并且所有催化残留物与前子mPPases3、9和Vigna radiata10 mPPase的求解结构具有特征。不同符合的TmPPase的可用结构也可用于基于结构的药物设计实验（如虚拟筛选和de novo设计）。
在这里，我们报告一个详细的协议，以96孔板格式筛选TmPPase抑制剂（图1）。该协议基于由菲斯克和Subbarow11首先开发的蓝色反应的色度测定方法。该方法涉及在酸性条件下从正磷酸盐和磷酸中形成12磷酸，然后减少，使具有特征的蓝绿色磷脂物质物种12。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们报告一个详细的协议，用于简单筛选从T.Maritima膜结合热磷酶的抑制剂在96井板格式基于Vidilaseris等人14。该协议是廉价的，基于12磷酸，这是由正磷酸盐和乙基在酸性条件下形成的，并减少到具有明显蓝色12的磷脂树种。此方法比其他协议更可取，如更敏感的马拉奇特绿色测定16，因为这种方法不显示干扰存在高磷脂浓度，这…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了简和Aatos Erkko基金会和BBSRC（BB/M021610）对阿德里安·戈德曼的资助， 芬兰学院（第308105号）给基尼·维迪拉利斯，（第310297号）到亨利·夏德，（第265481号）到贾里·伊利-考哈卢马，赫尔辛基大学研究基金给古斯塔夫·博伊耶·阿夫·根纳斯。作者感谢伯纳黛特·盖尔在项目期间提供的技术帮助。
Materials
| Adhesive sealing sheet | Thermo Scientific | AB0558 | |
| Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Merck | F1412481 636 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96Well Multidish | Thermo Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 1167431000 | |
| 8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) | Nippon genetics | FG-028 | |
| Dodecyl maltoside (DDM) | Melford | B2010-100G | |
| Ethanol | Merck | 1009901001 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 1000631011 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
| Imidodiphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin | Sigma | 429415-100GM | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan Ascent (Type 750) | Labsystems | ||
| Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Prism 6 software | GraphPad | ||
| QBT2 Heating block | Grant Instruments | ||
| Sodium meta-arsenite | Fisher Chemical | 12897692 | |
| Sodium phosphate dibasic (Pi) | Sigma | S0876-1KG | |
| Sodium pyrophosphate dibasic | Fluka | 71501-100G | |
| Trisodium citrate dihydrate | Fluka | 71404-1KG |
References
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