Triagem para inibidores da pirofosia ligada à membrana de maritoga
Summary
Aqui apresentamos um método de triagem para inibidores de pirofosfatase ligado à membrana (da Thermotoga maritima)com base na reação azul molibdênio em um formato de placa de 96 poços.
Abstract
Pirofosfatases ligadas à membrana (mPPases) são enzimas diméricas que ocorrem em bactérias, arqueais, plantas e parasitas protistas. Estas proteínas acovardam o pirofosfato em duas moléculas de ortofosfato, que é acoplado com próton e / ou íon de sódio bombeamento através da membrana. Como não existem proteínas homólogas em animais e humanos, os mPPases são bons candidatos na concepção de potenciais alvos de drogas. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para a tela para inibidores de mPase utilizando a reação azul molibdênio em um sistema de placa de 96 poços. Usamos mPase da bactéria termofílica Thermotoga maritima (TmPPase) como uma enzima modelo. Este protocolo é simples e barato, produzindo um resultado consistente e robusto. Leva apenas cerca de uma hora para concluir o protocolo de ensaio de atividade desde o início do ensaio até a medição de absorção. Uma vez que a cor azul produzida neste ensaio é estável por um longo período de tempo, ensaio (s) subseqüente pode ser realizado imediatamente após o lote anterior, e a absorção pode ser medida mais tarde para todos os lotes de uma só vez. A desvantagem deste protocolo é que ele é feito manualmente e, portanto, pode ser desgastante, bem como exigir boas habilidades de pipetting e tempo de manutenção. Além disso, a solução arsenite-citrate usada neste ensaio contém arsenita de sódio, que é tóxica e deve ser tratada com as precauções necessárias.
Introduction
Aproximadamente 25% do total de proteínas celulares são proteínas da membrana e cerca de 60% delas são alvos de drogas1,2. Um dos alvos potenciais da droga3, pirofosfofases ligados à membrana (mPPases), são enzimas diméricas que bombeiam próton e/ou íon de sódio através da membrana por hidróforadede de pirofosfato em dois ortopofosfatos4. mPPases podem ser encontrados em vários organismos5, como bactérias, archaea, plantas e parasitas protistas, com exceção de seres humanos e animais4. Em parasitas protistas, por exemplo Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii e Trypanosoma brucei, mPPases são essenciais para a virulência parasita6 e nocaute desta expressão nos parasitas levam à incapacidade de manter pH intracelular após a exposição ao pH básico externo7. Devido à sua importância e falta de proteína homóloga presente nos vertebrados, os mPPases podem ser considerados como alvos potenciais de medicamentos para doenças protistais3.
A triagem in vitro dos inibidores de mPase neste trabalho é baseada em um sistema modelo TmPPase. TmPPase é um bombeamento de íons de sódio e mPase dependente de íons de potássio de T. maritima e tem sua atividade ideal em 71 °C8. Os benefícios desta enzima são, por exemplo, a sua facilidade na produção e purificação, boa estabilidade térmica e alta atividade específica. TmPPase mostra alta semelhança, além da conservação completa da posição, bem como a identidade de todos os resíduos catalíticos para os mPPases protista3,9 e para a estrutura resolvida de Vigna radiata10 mPPase. As estruturas disponíveis de TmPPase em diferentes conformações também são úteis para experimentos de design de drogas baseados em estrutura (como triagem virtual e design de novo).
Aqui relatamos um protocolo detalhado para triagem de inibidores de TmPPase em um formato de placa de 96 poços (Figura 1). O protocolo é baseado no método colorimétrico da reação azul molibdênio, que foi desenvolvida pela primeira vez por Fiske e Subbarow11. Este método envolve a formação de ácido 12-fosphomolídico de ortopofosfato e molibdênio condições ácidas, que é então reduzida para dar a espécie de fosphomolybdenum de cor azul característica12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui relatamos um protocolo detalhado para triagem simples de inibidores para pirofosfatase ligada à membrana de T. maritima em um formato de placa de 96 poços baseado em Vidilaseris et al.14. Este protocolo é barato e baseado em ácido 12-fosphomolybdic, que é formado a partir de ortopofosfato e molibdênio em condições ácidas e reduzido a espécies de fosphomolybdenum com uma cor azul distinta12. Este método é preferido em relação a outros protocolos, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho contou com o apoio das subvenções da Fundação Jane e Aatos Erkko e do BBSRC (BB/M021610) a Adrian Goldman, a Academia da Finlândia (nº 308105) para Keni Vidilaseris (nº 310297) a Henri Xhaard, e (nº 265481) a Jari Yli-Kauhaluoma, e os Fundos de Helsínquia da Universidade de Pesquisa a Gustav Boije af Gennäs. Os autores agradecem a Bernadette Gehl por sua ajuda técnica durante o projeto.
Materials
| Adhesive sealing sheet | Thermo Scientific | AB0558 | |
| Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Merck | F1412481 636 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96Well Multidish | Thermo Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 1167431000 | |
| 8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) | Nippon genetics | FG-028 | |
| Dodecyl maltoside (DDM) | Melford | B2010-100G | |
| Ethanol | Merck | 1009901001 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 1000631011 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
| Imidodiphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin | Sigma | 429415-100GM | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan Ascent (Type 750) | Labsystems | ||
| Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Prism 6 software | GraphPad | ||
| QBT2 Heating block | Grant Instruments | ||
| Sodium meta-arsenite | Fisher Chemical | 12897692 | |
| Sodium phosphate dibasic (Pi) | Sigma | S0876-1KG | |
| Sodium pyrophosphate dibasic | Fluka | 71501-100G | |
| Trisodium citrate dihydrate | Fluka | 71404-1KG |
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