Screening for Thermotoga Maritima membranbundne Pyrofosfatasehæmmere
Summary
Her præsenterer vi en screeningmetode for membranbundne pyrofosfatase (fra Thermotoga Maritima) hæmmere baseret på molybdæn blå reaktion i en 96 brønd plade format.
Abstract
Membranbundne pyrofosfataser (Mppaser) er dikemeje enzymer, der forekommer i bakterier, archaea, planter og protist parasitter. Disse proteiner kløver pyrophosphat i to ortopæhosphat molekyler, som er kombineret med proton og/eller natrium ion pumpning på tværs af membranen. Da der ikke forekommer homologe proteiner hos dyr og mennesker, er mPPases gode kandidater i udformningen af potentielle stofmål. Her præsenterer vi en detaljeret protokol til skærmen for mPPase-hæmmere udnytte molybdæn blå reaktion i en 96 brønd plade system. Vi bruger mppase fra termofile bakterien thermotoga Maritima (tmppase) som en model enzym. Denne protokol er enkel og billig, hvilket giver et konsistent og robust resultat. Det tager kun ca. en time at fuldføre aktivitetsanalyse protokollen fra starten af analysen indtil absorbansmålingen. Da den blå farve, der produceres i denne analyse, er stabil i en længere periode, kan efterfølgende analyse (er) udføres umiddelbart efter det foregående parti, og absorbansen kan måles senere for alle batcher på samme tid. Ulempen ved denne protokol er, at det sker manuelt og dermed kan være udmattende samt kræve gode færdigheder af pipettering og tidsregistrering. Desuden indeholder arsenit-citrat-opløsningen, der anvendes i denne analyse, natriumarsenit, som er giftigt og bør håndteres med de nødvendige forholdsregler.
Introduction
Ca. 25% af de samlede cellulære proteiner er membran proteiner og omkring 60% af dem er narkotika mål1,2. En af de potentielle Drug mål3, membran-bundne pyrofosfataser (mppases), er dikemeje enzymer, der pumper proton og/eller natrium ion på tværs af membranen ved hydrolyse af pyrophosphat i to fra4. mPPases kan findes i forskellige organismer5 såsom bakterier, archaea, planter og protist parasitter, med undtagelse af mennesker og dyr4. I protist parasitter, for eksempel Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii og Trypanosoma brucei, mppases er afgørende for parasitten virulens6 og knockout af dette udtryk i parasitter føre til svigt i at opretholde intracellulære pH ved udsættelse for den eksterne grundlæggende pH7. På grund af deres betydning og mangel på homologt protein til stede i hvirveldyr, kan mPPases betragtes som potentielle Drug mål for protistal sygdomme3.
In vitro-screeningen af Mppasehæmmere i dette arbejde er baseret på et TmPPase-model system. TmPPase er en natrium-ion-pumpe og kalium-ion-afhængig mPPase fra T. Maritima og har sin optimale aktivitet ved 71 °c8. Fordelene ved dette enzym er for eksempel dets lethed i produktion og rensning, god termisk stabilitet og høj specifik aktivitet. Tmppase viser både høj lighed ud over den fuldstændige bevaring af positionen samt identiteten af alle katalytiske rester til den protist mppases3,9 og til den løste struktur af Vigna radiata10 mppase. De tilgængelige strukturer af TmPPase i forskellige konstellationer er også nyttige for struktur-baserede Drug Design eksperiment (som virtuel screening og de Novo design).
Her rapporterer vi en detaljeret protokol for screening af TmPPase-hæmmere i en 96 brønd plade format (figur 1). Protokollen er baseret på den kolorimetriske metode til molybdæn blå reaktion, som først blev udviklet af fiske og Subbarow11. Denne metode indebærer dannelsen af 12-phosphomolybdic fra orthophosphat og molybdæn under sure forhold, som derefter reduceres til at give karakteristiske blåfarvede phosphomolybdenumarter12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her rapporterer vi en detaljeret protokol til simpel screening af hæmmere for membranbundne pyrofosfatase fra T. Maritima i en 96 brønd plade format baseret på Vidilaseris et al.14. Denne protokol er billig og baseret på 12-phosphomolybdic, som er dannet af orthophosphat og molybdaten under sure betingelser og reduceret til phosphomolybdenumarter med en distinkt blå farve12. Denne metode foretrækkes frem for andre protokoller, såsom den mere følsomme malach…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskuddene fra Jane og Aatos Erkko Foundation og BBSRC (BB/M021610) til Adrian Goldman, det finske Akademi (nr. 308105) til Keni Vidilaseris, (nr. 310297) til Henri Xhaard og (nr. 265481) til Jari Yli-Kauhaluoma og universitetet i Helsinki forskningsmidler til Gustav Boije af Gennäs. Forfatterne takker Bernadette Gehl for hendes tekniske hjælp under projektet.
Materials
| Adhesive sealing sheet | Thermo Scientific | AB0558 | |
| Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Merck | F1412481 636 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96Well Multidish | Thermo Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 1167431000 | |
| 8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) | Nippon genetics | FG-028 | |
| Dodecyl maltoside (DDM) | Melford | B2010-100G | |
| Ethanol | Merck | 1009901001 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 1000631011 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
| Imidodiphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin | Sigma | 429415-100GM | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan Ascent (Type 750) | Labsystems | ||
| Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Prism 6 software | GraphPad | ||
| QBT2 Heating block | Grant Instruments | ||
| Sodium meta-arsenite | Fisher Chemical | 12897692 | |
| Sodium phosphate dibasic (Pi) | Sigma | S0876-1KG | |
| Sodium pyrophosphate dibasic | Fluka | 71501-100G | |
| Trisodium citrate dihydrate | Fluka | 71404-1KG |
References
- Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
- Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).
- Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens. AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).
- Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).
- Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. H+-PPases: yesterday, today and tomorrow. IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).
- Liu, J., et al. A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).
- Lemercier, G., et al. A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).
- Belogurov, G. A., et al. Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity. Biochimie. 44 (6), 2088-2096 (2005).
- Vidilaseris, K., et al. Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor. Science Advances. 5 (5), (2019).
- Lin, S. M., et al. Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase. Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).
- Fiske, C. H., Subbarow, Y. The colorimetric determination of phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).
- Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box. Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).
- Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases. Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).
- Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity. Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).
- He, Z. Q., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).
- Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin. Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).
- Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor. Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).
