थर्मोटोगा मैरिटिमा झिल्ली-बाउंड पायरोफोस्फेटेसे अवरोधकों के लिए स्क्रीनिंग
Summary
यहां हम झिल्ली से बंधे पायरोफोस्फेटेज़ (थर्मोटोगा मैरिटिमासे) अवरोधकों के लिए एक स्क्रीनिंग विधि प्रस्तुत करते हैं जो 96 अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में मोलिब्डेनम ब्लू रिएक्शन के आधार पर है।
Abstract
झिल्ली से बंधे पायरोफोस्फेटेस (एमपीए) डिमेरिक एंजाइम होते हैं जो बैक्टीरिया, आर्चिया, पौधों और प्रोटिस्ट परजीवी में होते हैं। ये प्रोटीन पायरोफॉस्फेट को दो ऑर्थोफोस्फेट अणुओं में छोड़ देते हैं, जो झिल्ली में प्रोटॉन और/या सोडियम आयन पंपिंग के साथ मिलकर होते हैं । चूंकि जानवरों और मनुष्यों में कोई समरूप प्रोटीन नहीं होता है, इसलिए एमपीए संभावित दवा लक्ष्यों के डिजाइन में अच्छे उम्मीदवार हैं। यहां हम 96 अच्छी प्लेट प्रणाली में मोलिब्डेनम ब्लू प्रतिक्रिया का उपयोग करते हुए एमपीपीए अवरोधकों के लिए स्क्रीन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम थर्मोफिलिक जीवाणु थर्मोटोगा मैरिटिमा (TmPPase) से एक मॉडल एंजाइम के रूप में mPPase का उपयोग करें । यह प्रोटोकॉल सरल और सस्ता है, जो एक सुसंगत और मजबूत परिणाम का उत्पादन करता है। यह केवल एक घंटे के बारे में लेता है गतिविधि परख प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए परख की शुरुआत से अवशोषण माप तक । चूंकि इस परख में उत्पादित नीला रंग लंबे समय तक स्थिर है, इसलिए बाद में परख (एस) पिछले बैच के तुरंत बाद किया जा सकता है, और अवशोषण को बाद में सभी बैचों के लिए एक बार में मापा जा सकता है। इस प्रोटोकॉल की खामी यह है कि यह मैन्युअल रूप से किया जाता है और इस प्रकार थकाऊ हो सकता है और साथ ही पाइपटिंग और समय रखने के अच्छे कौशल की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, इस परख में इस्तेमाल आर्सेनिट-साइट्रेट समाधान में सोडियम आर्सेनिट होता है, जो विषाक्त होता है और आवश्यक सावधानियों के साथ संभाला जाना चाहिए।
Introduction
कुल सेलुलर प्रोटीन का लगभग 25% झिल्ली प्रोटीन है और उनमें से लगभग 60% दवा लक्ष्य1,2हैं . संभावित दवालक्ष्य3,झिल्ली से बंधे पायरोफॉस्फेटेस (एमपीएई) के लक्ष्यों में से एक, डिमेरिक एंजाइम हैं जो पायरोफॉस्फेट के हाइड्रोलिसिस द्वारा झिल्ली के पार प्रोटॉन पंप और/या सोडियम आयन को दो ऑर्थोफोस्फेट4में डालते हैं। MPPases मनुष्यों औरजानवरोंके अपवाद केसाथ, बैक्टीरिया, आर्चिया, पौधों और प्रोटिस्ट परजीवी जैसे 5 विभिन्न जीवों में पाया जा सकता है। प्रोटिस्ट परजीवी में, उदाहरण के लिए प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम, टॉक्सोप्लाज्मा गोंडी और ट्राइपानोसोमा ब्रूसी,एमपीपीए परजीवी उग्रता6 और परजीवी में इस अभिव्यक्ति के नॉकआउट के लिए आवश्यक हैं, बाहरी बुनियादी पीएच7के संपर्क में आने पर इंट्रासेलुलर पीएच को बनाए रखने में विफलता का कारण बनते हैं। कशेरुकी में मौजूद उनके महत्व और अाचार प्रोटीन की कमी के कारण, एमपीपीए को प्रोटिस्टल रोगों के लिए संभावित दवा लक्ष्य माना जा सकता है3।
इस काम में एमपीपासे अवरोधकों की इन विट्रो स्क्रीनिंग एक TmPPase मॉडल प्रणाली पर आधारित है। TmPPase टी मैरिटिमा से एक सोडियम आयन पंपिंग और पोटेशियम आयन निर्भर mPPase है और 71 डिग्री सेल्सियस8पर अपनी इष्टतम गतिविधि है। इस एंजाइम के लाभ उदाहरण के लिए उत्पादन और शुद्धिकरण, अच्छी थर्मल स्थिरता और उच्च विशिष्ट गतिविधि में इसकी आसानी है। TmPPase स्थिति के पूर्ण संरक्षण के अलावा दोनों उच्च समानता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रोटीस्ट mPPases3,9 और विग्ना रेडिएटा10 mPPase की हल संरचना के लिए सभी उत्प्रेरक अवशेषों की पहचान से पता चलता है । विभिन्न संरचनाओं में TmPPase की उपलब्ध संरचनाएं संरचना-आधारित दवा डिजाइन प्रयोग (आभासी स्क्रीनिंग और डी नोवो डिजाइन के रूप में) के लिए भी उपयोगी हैं।
यहां हम 96 अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप(चित्रा 1)में TmPPase अवरोधकों की स्क्रीनिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं। प्रोटोकॉल मोलिब्डेनम ब्लू रिएक्शन की रंगीन विधि पर आधारित है, जिसे पहले फिस्के और सुब्बारो11द्वारा विकसित किया गया था। इस विधि में अम्लीय परिस्थितियों में ऑर्थोहोस्फेट और मोलिबडेट से 12-फॉस्फोमोलिथिक एसिड का गठन शामिल है, जिसे तब विशिष्ट नीले रंग की फॉस्फोमोलिब्डेनम प्रजातियोंको 12देने के लिए कम किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम विडिलेरिस एट अल14के आधार पर 96 वेल प्लेट प्रारूप में टी मैरिटिमा से झिल्ली से बंधे पायरोफोस्फेटेज़ के लिए अवरोधकों की सरल स्क्रीनिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं।…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को जेन और Aatos Erkko फाउंडेशन और BBSRC (BB/M021610) से एड्रियन गोल्डमैन को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, फिनलैंड अकादमी (नंबर 308105) केनी विडिलेरिस, (नंबर 310297) से हेनरी Xhaard, और (नंबर 265481) को जरी येली-काउहल्लुमा, और यूनिवर्सिटी ऑफ हेलसिंकी रिसर्च फंड्स से गुस्ताव बोइजे एएफ जेनास। लेखक परियोजना के दौरान उसकी तकनीकी मदद के लिए बर्नाडेट गेहल का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| Adhesive sealing sheet | Thermo Scientific | AB0558 | |
| Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Merck | F1412481 636 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96Well Multidish | Thermo Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 1167431000 | |
| 8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) | Nippon genetics | FG-028 | |
| Dodecyl maltoside (DDM) | Melford | B2010-100G | |
| Ethanol | Merck | 1009901001 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 1000631011 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
| Imidodiphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin | Sigma | 429415-100GM | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan Ascent (Type 750) | Labsystems | ||
| Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Prism 6 software | GraphPad | ||
| QBT2 Heating block | Grant Instruments | ||
| Sodium meta-arsenite | Fisher Chemical | 12897692 | |
| Sodium phosphate dibasic (Pi) | Sigma | S0876-1KG | |
| Sodium pyrophosphate dibasic | Fluka | 71501-100G | |
| Trisodium citrate dihydrate | Fluka | 71404-1KG |
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