Detección de inhibidores de la pirofosfatasa ligadas a la membrana Thermotoga maritima
Summary
Aquí presentamos un método de cribado para inhibidores de la pirofosfatasa ligada a la membrana (de Thermotoga maritima)basado en la reacción azul de molibdeno en un formato de placa de 96 pocillos.
Abstract
Las pirofosfasiasas ligadas a la membrana (mPPases) son enzimas dimericas que se producen en bacterias, arqueas, plantas y parásitos protistas. Estas proteínas clan el pirofosfato en dos moléculas de ortofosfato, que se combina con el bombeo de protones y/o iones de sodio a través de la membrana. Dado que no se producen proteínas homólogas en animales y humanos, los mPPases son buenos candidatos en el diseño de posibles objetivos farmacológicos. Aquí presentamos un protocolo detallado para detectar inhibidores de mPPase utilizando la reacción azul de molibdeno en un sistema de placa de pozo 96. Utilizamos mPPase de la bacteria termofílica Thermotoga maritima (TmPPase) como enzima modelo. Este protocolo es simple y económico, produciendo un resultado consistente y robusto. La medición de la absorbancia tarda sólo una hora en completar el protocolo de ensayo de actividad desde el inicio del ensayo hasta la medición de absorción. Dado que el color azul producido en este ensayo es estable durante un largo período de tiempo, los ensayos posteriores se pueden realizar inmediatamente después del lote anterior, y la absorbancia se puede medir más tarde para todos los lotes a la vez. El inconveniente de este protocolo es que se hace manualmente y por lo tanto puede ser agotador, así como requerir buenas habilidades de pipeteo y mantenimiento del tiempo. Además, la solución de arsénito-citrato utilizada en este ensayo contiene arsnito sódico, que es tóxico y debe tratarse con las precauciones necesarias.
Introduction
Aproximadamente el 25% del total de proteínas celulares son proteínas de membrana y alrededor del 60% de ellas son dianas de fármacos1,2. Uno de los fármacos potenciales se dirige a3, pirofosfatasas ligadas a la membrana (mPPases), son las enzimas dimericas que bombean protones y/o iones de sodio a través de la membrana por hidrólisis de pirofosfato en dos ortofosfatos4. mPPases se pueden encontrar en varios organismos5 tales como bacterias, arqueas, plantas, y parásitos protistas, con la excepción de los seres humanos y animales4. En los parásitos protistas, por ejemplo Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii y Trypanosoma brucei,las mPPases son esenciales para la virulencia del parásito6 y el nocaut de esta expresión en los parásitos conducen a la falla en el mantenimiento del pH intracelular tras la exposición al pH básico externo7. Debido a su importancia y falta de proteína homóloga presente en los vertebrados, las mPPases pueden considerarse como posibles dianas farmacológicas para enfermedades protistales3.
El cribado in vitro de inhibidores de mPPase en este trabajo se basa en un sistema modelo TmPPase. TmPPase es un mPPase dependiente del bombeo de iones de sodio y iones de potasio de T. maritima y tiene su actividad óptima a 71oC8. Los beneficios de esta enzima son, por ejemplo, su facilidad en la producción y purificación, una buena estabilidad térmica y una alta actividad específica. TmPPase muestra tanto una alta similitud además de la conservación completa de la posición como la identidad de todos los residuos catalíticos al protista mPPases3,9 y a la estructura resuelta de Vigna radiata10 mPPase. Las estructuras disponibles de TmPPase en diferentes conformaciones también son útiles para el experimento de diseño de fármacos basado en estructuras (como cribado virtual y diseño de novo).
Aquí informamos de un protocolo detallado para el cribado de inhibidores de TmPPase en un formato de placa de pozo 96 (Figura 1). El protocolo se basa en el método colorimétrico de la reacción azul de molibdeno, que fue desarrollado por primera vez por Fiske y Subbarow11. Este método implica la formación de ácido 12-fosfomolíbdico a partir de ortofosfato y molibdato en condiciones ácidas, que luego se reduce para dar especies características de fosfomolibdeno de color azul12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí informamos de un protocolo detallado para el cribado simple de inhibidores de la pirofosfatasa ligada a la membrana de T. maritima en un formato de placa de 96 pozos basado en Vidilaseris et al.14. Este protocolo es barato y se basa en ácido 12-fosfomolíbódico, que se forma a partir de ortofosfato y molibdato en condiciones ácidas y reducido a especies de fosfomolibdeno con un color azul distintivo12. Este método es preferido sobre otros protocolos, como…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de la Fundación Jane y Aatos Erkko y la BBSRC (BB/M021610) a Adrian Goldman, la Academia de Finlandia (no 308105) a Keni Vidilaseris, (no 310297) a Henri Xhaard, y (no 265481) a Jari Yli-Kauhaluoma, y los Fondos de Investigación de la Universidad de Helsinki a Gustav Boije af Genns. Los autores agradecen a Bernadette Gehl por su ayuda técnica durante el proyecto.
Materials
| Adhesive sealing sheet | Thermo Scientific | AB0558 | |
| Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Merck | F1412481 636 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96Well Multidish | Thermo Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 1167431000 | |
| 8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) | Nippon genetics | FG-028 | |
| Dodecyl maltoside (DDM) | Melford | B2010-100G | |
| Ethanol | Merck | 1009901001 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 1000631011 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
| Imidodiphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin | Sigma | 429415-100GM | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan Ascent (Type 750) | Labsystems | ||
| Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Prism 6 software | GraphPad | ||
| QBT2 Heating block | Grant Instruments | ||
| Sodium meta-arsenite | Fisher Chemical | 12897692 | |
| Sodium phosphate dibasic (Pi) | Sigma | S0876-1KG | |
| Sodium pyrophosphate dibasic | Fluka | 71501-100G | |
| Trisodium citrate dihydrate | Fluka | 71404-1KG |
References
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