Screening för Thermotoga maritima membran-bundna Pyrofosfatashämmare
Summary
Här presenterar vi en screeningmetod för membran bunden pyrofosfatas (från Thermotoga maritima) hämmare baserat på molybden blå reaktionen i en 96 väl plåtformat.
Abstract
Membran-bundna pyrofoshataser (mppases) är dimeriskt enzymer som förekommer i bakterier, Archaea, växter, och protistiska parasiter. Dessa proteiner klyva pyrofosfat i två ortofosfat molekyler, som är tillsammans med Proton och/eller natrium Jon pumpar över membranet. Eftersom inga homolog proteiner förekommer hos djur och människor är Mppaser bra kandidater i utformningen av potentiella läkemedelsmål. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll till Screen för mPPase hämmare utnyttjar molybden blå reaktionen i en 96 väl plattan system. Vi använder mPPase från den termofila bakterien Thermotoga maritima (tmppase) som ett modell enzym. Detta protokoll är enkelt och billigt, vilket ger ett konsekvent och robust resultat. Det tar bara ungefär en timme att slutföra den Activity assay Protocol från början av analysen tills absorbans mätningen. Eftersom den blå färgen som produceras i denna analys är stabil under en lång tidsperiod, kan efterföljande analys (er) utföras omedelbart efter den föregående omgången, och absorbansen kan mätas senare för alla partier på en gång. Nackdelen med detta protokoll är att det görs manuellt och därmed kan vara ansträngande samt kräver god kompetens för pipettering och tidhållning. Vidare, den arsenite-citrat lösning som används i denna analys innehåller natriumarsenit, som är giftigt och bör hanteras med nödvändiga försiktighetsåtgärder.
Introduction
Cirka 25% av de totala cellulära proteinerna är membranproteiner och omkring 60% av dem är drog mål1,2. En av de potentiella drogen mål3, membran-bundna pyrofoshataser (mppases), är dimeriskt enzymer som pumpar Proton och/eller natrium Jon över membranet genom hydrolys av pyrofosfat i två ortofosfat4. Mppaser kan hittas i olika organismer5 såsom bakterier, Archaea, växter, och protistiska parasiter, med undantag för människor och djur4. I protist parasiter, till exempel Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii och Trypanosoma rhodesiense, mppases är viktiga för parasiten virulens6 och knockout av detta uttryck i parasiterna leda till misslyckande i att upprätthålla intracellulära pH vid exponering för den yttre grundläggande pH7. På grund av deras betydelse och brist på homolog protein som finns i ryggradsdjur, kan Mppaser betraktas som potentiella läkemedelsmål för protistal sjukdomar3.
In vitro-screening av Mppashämmare i detta arbete är baserad på ett TmPPase-modellsystem. TmPPase är en natrium Jon pumpning och kalium Jon beroende mPPase från T. maritima och har sin optimala aktivitet vid 71 ° c8. Fördelarna med detta enzym är till exempel dess lätthet i produktion och rening, bra termisk stabilitet och hög specifik aktivitet. Tmppase visar både en hög likhet utöver det fullständiga bevarandet av positionen samt identiteten hos alla katalytiska rester till de protistiska mppases3,9 och den lösta strukturen av Vigna radiata10 mppase. De tillgängliga strukturerna för TmPPase i olika konformationer är också användbara för strukturbaserade läkemedel design experiment (som virtuell screening och de Novo design).
Här rapporterar vi ett detaljerat protokoll för screening av Tmppashämmare i en 96 väl plåtformat (figur 1). Protokollet är baserat på den kolorimetriska metoden i den molybdenblå reaktionen, som först utvecklades av fiske och Subbarow11. Denna metod innebär bildandet av 12-phosphomolybdic syra från ortofosfat och molybdat under sura förhållanden, som sedan reduceras för att ge karakteristiska blå-färgade foshomolybdenum arter12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här rapporterar vi ett detaljerat protokoll för enkel screening av hämmare för membran bunden pyrofosfatas från T. maritima i en 96 väl plåtformat baserat på Vidilaseris et al.14. Detta protokoll är billigt och baserat på 12-phosphomolybdic syra, som bildas från ortofosfat och molybdat under sura förhållanden och reduceras till foshomolybdenum arter med en distinkt blå färg12. Denna metod är att föredra framför andra protokoll, såsom den känslig…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidragen från Jane och Aatos Erkkos stiftelse och BBSRC (BB/M021610) till Adrian Goldman, Finlands Akademi (nr 308105) till Keni Vidilaseris, (nr 310297) till Henri Xhaard, och (nr 265481) till Jari Yli-Kauhaluoma, och Helsingfors universitets forskningsfonder till Gustav Boije af Gennäs. Författarna tackar Bernadette Gehl för hennes tekniska hjälp under projektet.
Materials
| Adhesive sealing sheet | Thermo Scientific | AB0558 | |
| Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Merck | F1412481 636 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96Well Multidish | Thermo Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 1167431000 | |
| 8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) | Nippon genetics | FG-028 | |
| Dodecyl maltoside (DDM) | Melford | B2010-100G | |
| Ethanol | Merck | 1009901001 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 1000631011 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
| Imidodiphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin | Sigma | 429415-100GM | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan Ascent (Type 750) | Labsystems | ||
| Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Prism 6 software | GraphPad | ||
| QBT2 Heating block | Grant Instruments | ||
| Sodium meta-arsenite | Fisher Chemical | 12897692 | |
| Sodium phosphate dibasic (Pi) | Sigma | S0876-1KG | |
| Sodium pyrophosphate dibasic | Fluka | 71501-100G | |
| Trisodium citrate dihydrate | Fluka | 71404-1KG |
References
- Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
- Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).
- Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens. AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).
- Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).
- Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. H+-PPases: yesterday, today and tomorrow. IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).
- Liu, J., et al. A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).
- Lemercier, G., et al. A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).
- Belogurov, G. A., et al. Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity. Biochimie. 44 (6), 2088-2096 (2005).
- Vidilaseris, K., et al. Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor. Science Advances. 5 (5), (2019).
- Lin, S. M., et al. Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase. Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).
- Fiske, C. H., Subbarow, Y. The colorimetric determination of phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).
- Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box. Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).
- Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases. Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).
- Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity. Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).
- He, Z. Q., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).
- Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin. Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).
- Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor. Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).
