זיהוי מעכבי של האינטראקציה HBx-DDB1 באמצעות פיצול לוציפראז מערכת המערכת
Summary
כאן, אנו מציגים שיטה להקרנה אנטי צהבת B סוכנים ויראליים לעכב את האינטראקציה HBx-DDB1 באמצעות פיצול לוציפראז מערכת שיטת. מערכת זו מאפשרת זיהוי קל של אינטראקציות חלבון-חלבון והיא מתאימה לזיהוי מעכבי של אינטראקציות כאלה.
Abstract
יש צורך דחוף סוכנים טיפוליים חדשניים עבור צהבת B וירוס (HBV) זיהום. למרות שהנוקלאונוס הזמינים כרגע (t) מעכבים שכפול ויראלי, אין להם השפעה ישירה על הביטוי של חלבונים ויראליות ששועתק מתוך דנ א ויראלי סגור DNA עגול (cccDNA). כמו לטעון אנטיגן ויראלי גבוהה עשוי לשחק תפקיד זה כרונית ו-HBV הקשורים קרצינובגנזה, המטרה של הטיפול HBV היא לבער חלבונים ויראלי. החלבון HBV התקינה X (HBx) נקשר ל-DNA מארח נזק מחייב חלבון 1 (DDB1) חלבון כדי לבזות תחזוקה מבנית של כרומוזומים 5/6 (Smc5/6), וכתוצאה מכך הפעלת תמלול ויראלי מ cccDNA. כאן, באמצעות מפוצל לוציפראז מערכת שיטת הטיפול, אנו מציגים מערכת מקיפה הקרנת מתחם כדי לזהות מעכבי של האינטראקציה HBx-DDB1. הפרוטוקול שלנו מאפשר זיהוי קל של הדינמיקה ההדדית בזמן אמת בתוך תאים חיים. טכניקה זו עשויה להפוך להיות מפתח מרכזי כדי לגלות סוכנים טיפוליים חדשניים לטיפול בזיהום HBV.
Introduction
צהבת B וירוס (HBV) זיהום הוא בריאות הציבור העיקרי הדאגה ברחבי העולם, עם הערכות שנתיות של 240,000,000 אנשים באופן כרוני נגוע HBV ו 90,000 מקרי מוות עקב סיבוכים מן הזיהום, כולל שחמת וקרצינומה hepatocellular (HCC)1. למרות שהסוכנים הטיפוליים הנוכחיים אנטי-HBV, הנוקלאואים (t) ide, מעכבים מספיק שעתוק ויראלי, הם לרוב משיגים את חיסול החלבונים הנגידיים, שהיא המטרה הקלינית ארוכת הטווח. ההשפעה הירודה שלהם על חיסול חלבון נגיפי נובע היעדר השפעה ישירה על תמלול ויראלי מ epiזומביים ויראלי סגור DNA מעגלי (cccDNA) מיני כרומוזומי בגרעין hepatocyte2.
תמלול HBV מופעל ע י חלבון התקינה HBV X (HBx)3. מחקרים שנעשו לאחרונה חשפה כי HBx מוחלק תחזוקה מבנית של כרומוזומים 5/6 (Smc5/6), גורם הגבלה מארח כי חוסם hbv תמלול מ cccdna, באמצעות חטיפת DDB1-CUL4-ROC1 E3 אוביקוויב ליגאז קומפלקס4,5,6. לכן, צעד מכריע בקידום תמלול ויראלי מ-cccDNA נחשב לאינטראקציה HBx-DDB1. תרכובות מסוגלות לעכב את הכריכה בין HBx ו-DDB1 עשוי לחסום תמלול ויראלי, ואכן nitazoxanide זוהה כמדכא של האינטראקציה HBx-DDB1 באמצעות מערכת הקרנה שפותחה במעבדה שלנו7.
כאן, אנו מציגים את מערכת ההקרנה הנוחה שלנו משמש לזיהוי מעכבי של HBx-DDB1 אינטראקציה, אשר משתמשת מפוצל לוציפראאז שיטה משלימה7,8. פיצול יחידות משנה מפוצל ל HBx ו DDB1, ואת האינטראקציה HBx-DDB1 מביא את תת היחידות לתוך קרוב ליצור אנזים פונקציונלי שמייצר אות זורח בהיר. כאשר האינטראקציה בין תת היחידות היא הפיכה, מערכת זו יכולה לזהות במהירות HBx-DDB1 חלבונים (איור 1). באמצעות מערכת זו, ספריית מתחם גדול ניתן להקרנה בקלות, אשר עשוי לגרום לגילוי של תרכובות הרומן מסוגל לעכב ביעילות את HBx-DDB1 אינטראקציה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פיתחנו שיטת הקרנה נוחה באמצעות מפוצל לוציפראז למצוא מעכבי HBx-DDB1 קשירה. הדינמיקה אינטראקציה ניתן לזהות בזמן אמת בתאי החיים ללא צורך בפירוק תאים. עיכוב של HBx-DDB1 אינטראקציה מוביל שחזור של Smc5/6, אשר גורמת לדיכוי של תמלול ויראלי, ביטוי חלבון, ו cccDNA ייצור7. זה מנגנון הרומן של פעולה אנטי…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים בסיוע ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה, יפן (#19H03430 ו#17K09405 לשיטת הפעולה, ו #19J11829 ל K.S.), על ידי גרנט-in-Aid עבור מחקר מדעי על אזורים חדשניים (#18H05024 לשיטת הפעולה), על ידי תוכנית מחקר על הפטיטיס מן הסוכנות היפנית למחקר ופיתוח, (כדי שיטת פעולה, #JP19fk021005), על ידי תוכנית על פיתוח חדשני ויישום של תרופות חדשות עבור צהבת B (#JP19fk0310102 K.K.) מ-, על ידי הקרן היפנית עבור אנזיולוגיה שימושית ומקרן קוביאשי לחקר הסרטן (כדי שיטת פעולה), על ידי יפן GSK מחקר מענק 2018 (כדי K.S.), ועל ידי מענק מן הקרן מייקאווה מחקר הזיכרון (כדי K.S.).
Materials
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
- Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. Chronic hepatitis B infection: a review. The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).
- Sekiba, K., et al. Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA. World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).
- Slagle, B. L., Bouchard, M. J. Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402 (2016).
- Murphy, C. M., et al. Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication. Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).
- Decorsière, A., et al. Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor. Nature. 531, 386-389 (2016).
- Niu, C., et al. The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection. PLoS One. 12, e0169648 (2017).
- Sekiba, K., et al. Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).
- Eggers, C. T., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: Methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648 (2014).
- Michael, S., et al. A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).
- Skwarczynska, M., Ottmann, C. Protein-protein interactions as drug targets. Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).
- de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery. Genome Medicine. 6, 115 (2014).
- Prasad, M., et al. Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens. Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).
