분할 루시퍼라아제 분석 시스템을 사용하여 HBx-DDB1 상호 작용의 억제제 식별
Summary
여기서, 우리는 분할 루시퍼라아제 분석 시스템을 사용하여 HBx-DDB1 상호작용을 억제하는 항-B형 간염 바이러스 성 물질을 스크리닝하는 방법을 제시한다. 이 시스템은 단백질-단백질 상호 작용의 쉬운 검출을 허용하고 그 같은 상호 작용의 억제제를 확인하기 위해 적당합니다.
Abstract
B형 간염 바이러스(HBV) 감염에 대한 새로운 치료제에 대한 긴급한 필요성이 있다. 현재 유효한 핵 (t)ide 유사체는 바이러스 복제를 강력하게 억제하지만, 그들은 바이러스 공유 폐쇄 원형 DNA (cccDNA)에서 전사 된 바이러스 성 단백질의 발현에 직접적인 영향을 미치지 않습니다. 높은 바이러스 항원 부하가 이 만성 및 HBV 관련 발암에 역할을 할 수 있기 때문에, HBV 처리의 목표는 바이러스 성 단백질을 근절하는 것입니다. HBV 조절 단백질 X (HBx)는 cccDNA에서 바이러스 전사의 활성화의 결과로 염색체 5/6 (Smc5/6)의 구조적 유지 보수를 저하시키기 위해 숙주 DNA 손상 결합 단백질 1 (DDB1) 단백질에 결합합니다. 여기서, 분할 루시퍼라제 보완 분석 시스템을 사용하여, 우리는 HBx-DDB1 상호작용의 억제제를 식별하기 위한 포괄적인 화합물 스크리닝 시스템을 제시한다. 우리의 프로토콜은 살아있는 세포 내에서 실시간으로 상호 작용 역학의 쉬운 검출을 가능하게합니다. 이 기술은 HBV 감염의 처리를 위한 새로운 치료제를 발견하는 중요한 분석사가 될 수 있습니다.
Introduction
B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 전 세계적으로 주요 공중 보건 문제이며, 연간 2억 4천만 명이 HBV에 만성 감염되고 간경변및 간세포암(HCC)을 포함한 감염합병증으로인한 90,000명의 사망자가 발생한다. 현재 항-HBV 치료제인 뉴클레오스(t)ide 유사체는 바이러스 역 전사를 충분히 억제하지만, 장기적인 임상 목표인 바이러스 성 단백질의 제거를 거의 달성하지 못한다. 바이러스 성 단백질 제거에 대한 그들의 나쁜 효과는 간세포핵2에서에피솜 바이러스 성 공유 폐쇄 원형 DNA (cccDNA) 미니 염색체에서 바이러스 전사에 대한 직접적인 영향의 부족으로 인한 것입니다.
HBV 전사는 HBV 조절 X (HBx) 단백질3에의해 활성화됩니다. 최근 연구에 따르면 HBx는 DDB1-CUL4-ROC1 E3 유비퀴틴 리가제 복합체4,5,6을납치하여 cccDNA에서 HBV 전사를 차단하는 숙주 제한 인자인 염색체 5/6(Smc5/6)의 구조적 유지를 저하시키는 것으로 나타났습니다. 따라서, cccDNA로부터의 바이러스 전사를 촉진하는 중요한 단계는 HBx-DDB1 상호작용으로 생각된다. HBx와 DDB1 사이의 결합을 억제할 수 있는 화합물은 바이러스 전사를 차단할 수 있으며, 실제로 니타옥산화물은 실험실에서 개발된 스크리닝 시스템을 통해 HBx-DDB1 상호작용의 억제제로 확인되었다7.
여기서, 우리는 분할 루시퍼라제 상보적분석7,8을활용하는 HBx-DDB1 상호작용의 억제제를 식별하는 데 사용되는 편리한 스크리닝 시스템을 제시한다. 분할 루시퍼라제 서브유닛은 HBx 및 DDB1에 융합되고, HBx-DDB1 상호작용은 소단위를 근접하게 하여 밝은 발광 신호를 생성하는 기능성 효소를 형성합니다. 소단위 간의 상호작용이 가역적이기 때문에, 이 시스템은 HBx-DDB1 단백질을 빠르게 해리시키는 것을 검출할 수있다(도 1). 이 시스템을 사용하여, 큰 화합물 라이브러리는 쉽게 스크리닝될 수 있으며, 이는 HBx-DDB1 상호작용을 효율적으로 억제할 수 있는 새로운 화합물의 발견을 초래할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 HBx-DDB1 결합 억제제를 찾기 위해 분할 루시퍼라아제 분석법을 사용하여 편리한 스크리닝 방법을 개발했습니다. 상호작용 역학은 세포 용해없이 살아있는 세포에서 실시간으로 검출될 수 있다. HBx-DDB1 상호 작용의 억제는 Smc5/6의 복원으로 이어지며, 이는 바이러스 전사, 단백질 발현 및 cccDNA 생산의 억제를 초래한다7. 항 바이러스 작용의 이 새로운 기계장치는 현재 HBV 치?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 문부과학성의 보조금 지원으로 지원되었으며, 일본 스포츠, 과학 기술, 일본 (#19H03430 및 #17K09405 M.O., 그리고 K.S.에 #19J11829), 혁신적인 분야에 대한 과학 연구를위한 보조금에 의해 (#18H05024 M.O.), 일본 의학 연구 개발 기관에서 간염에 대한 연구 프로그램에 의해, AMED (M.O., #JP19fk021005), 혁신적인 개발 및 B에 대한 신약의 응용 프로그램에 의해 (M.O.에), 암 간염에 대한 새로운 약물의 응용 프로그램에 의해 (M.O.에), AB에 의해 #JP19fk0310102 일본 응용지질학재단과 고바야시 암연구재단(M.O.), GSK 재팬 연구보조금 2018(K.S.) 및 미야카와 기념연구재단(K.S.)의 보조금으로 지원.
Materials
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
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