Visualisierung des Makrophagen-Lytic Zelltodes während der mykobakteriellen Infektion bei Zebrafischembryonen mittels Intravital-Mikroskopie
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Visualisierung des Makrophagenverhaltens und des Todes bei embryonalen Zebrafischen während einer Mycobacterium marinum-Infektion. Schritte zur Herstellung von Bakterien, Infektionder tenatierter Embryonen und intravitale Mikroskopie sind enthalten. Diese Technik kann auf die Beobachtung von Zellverhalten und Tod in ähnlichen Szenarien mit Infektion oder sterile Entzündung angewendet werden.
Abstract
Zebrafish ist ein ausgezeichneter Modellorganismus für die Untersuchung des angeborenen Immunzellverhaltens aufgrund seiner transparenten Natur und der Abhängigkeit ausschließlich von seinem angeborenen Immunsystem während der frühen Entwicklung. Das Infektionsmodell des Zebrafischs Mycobacterium marinum (M. marinum) hat sich bei der Untersuchung der Immunantwort des Wirts gegen mykobakterielle Infektionen etabliert. Es wurde vorgeschlagen, dass verschiedene Makrophagenzell-Todestypen zu den verschiedenen Ergebnissen einer mykobakteriellen Infektion führen werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit Intravital-Mikroskopie, um den Tod von Makrophagenzellen in Zebrafisch-Embryonen nach einer M. marinum-Infektion zu beobachten. Zebrafisch transgene Linien, die speziell Makrophagen und Neutrophile kennzeichnen, werden durch intramuskuläre Mikroinjektion von fluoreszierend M. marinum entweder im Mittelhirn oder im Rumpf infiziert. Infizierte Zebrafisch-Embryonen werden anschließend auf niedrigschmelzender Agarose montiert und durch konfokale Mikroskopie in X-Y-Z-T-Dimensionen beobachtet. Da langzeitige Live-Bildgebung niedrige Laserleistung erfordert, um Photobleichungen und Phototoxizität zu vermeiden, wird eine stark exsemitende transgene empfohlen. Dieses Protokoll erleichtert die Visualisierung der dynamischen Prozesse in vivo, einschließlich Immunzellmigration, Interaktion mit Wirtspathogenen und Zelltod.
Introduction
Eine mykobakterielle Infektion hat gezeigt, dass sie zum Tod von Immunzellenführt 1. Beispielsweise löst ein abgeschwächter Stamm Apoptose in Makrophagen aus und enthält die Infektion. Jedoch, ein virulenter Stamm wird lytische Zelltod auslösen, was bakterielle Verbreitung1,2. In Anbetracht der Auswirkungen dieser verschiedenen Arten von Zelltod auf die antimykobakterielle Reaktion des Wirts ist eine detaillierte Beobachtung des Todesfälles von Makrophagenzellen während einer mykobakteriellen Infektion in vivo erforderlich.
Die herkömmlichen Methoden zur Messung des Zelltodes sind die Verwendung von toten Zellflecken, wie Annnexin V, TUNEL oder Acridin orange/propidiumiodid Färbung3,4,5. Diese Methoden sind jedoch nicht in der Lage, Licht auf den dynamischen Prozess des Zelltodes in vivo zu werfen. Die Beobachtung des Zelltodes in vitro wurdebereits durch Live-Bildgebung 6 erleichtert. Ob die Ergebnisse jedoch die physiologischen Bedingungen genau imitieren, bleibt unklar.
Zebrafische waren ein ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung von Host Anti-Mycobacterium Antworten. Es hat ein hochkonserviertes Immunsystem ähnlich dem des Menschen, ein leicht zu manipulierendes Genom, und die frühen Embryonen sind transparent, was eineliveeBildgebung 7,8,9ermöglicht. Nach einer Infektion mit M. marinum bilden erwachsene Zebrafische typische reife Granulomstrukturen, und embryonale Zebrafische bilden frühe Somaulom-ähnliche Strukturen9,10. Der dynamische Prozess der angeborenen Immunzell-Bakterien-Interaktion wurde zuvor im Zebrafisch M. marinum Infektionsmodell11,12untersucht. Aufgrund der hohen räumlich-zeitlichen Auflösung bleiben die Details rund um den Tod der angeborenen Immunzellen jedoch weitgehend undefiniert.
Hier beschreiben wir, wie der Prozess des makrophagenlytischen Zelltodes visualisiert wird, der durch eine mykobakterielle Infektion in vivo ausgelöst wird. Dieses Protokoll kann auch auf die Visualisierung zellulärer Verhalten in vivo während der Entwicklung und Entzündung angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Visualisierung des Makrophagensterbens während einer mykobakteriellen Infektion. Basierend auf Faktoren wie der Integrität der Zellmembran kann der infektionsgetriebene Zelltod in Apoptose und lytischen Zelltod24,25unterteilt werden. Lytischer Zelltod ist für den Organismus stressiger als Apoptose, weil er eine starke Entzündungsreaktion auslöst 24,25. Die Beobachtung …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Zilong Wen für die gemeinsame Nutzung von Zebrafischstämmen, Dr. Stefan Oehlers und Dr. David Tobin für die gemeinsame Nutzung der Ressourcen von M. marinum, Yuepeng He für die Unterstützung bei der Figurenvorbereitung. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81801977) (B.Y.), dem Outstanding Youth Training Program of Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai Sailing Program (18YF1420400) (B.Y.) und Open Fund of Shanghai Key Laboratory of Tuberculosis (2018YQ54) (B.Y.) (B.Y.) unterstützt.
Materials
| 0.05% Tween-80 | Sigma | P1379 | |
| 10 mL syringe | Solarbio | YA0552 | |
| 10% OADC | BD | 211886 | |
| 3-aminobenzoic acid | Sigma | E10521 | |
| 5 μm filter | Mille X | SLSV025LS | |
| 50 μl/ml hygromycin | Sangon Biotech | A600230 | |
| 7H10 | BD | 262710 | |
| 7H9 | BD | 262310 | |
| A glass bottom 35 mm dish | In Vitro Scientific | D35-10-0-N | |
| Agarose | Sangon Biotech | A60015 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Enviromental Chamber | Pecon | temp control 37-2 digital | |
| Eppendorf microloader | Eppendorf | No.5242956003 | |
| Glass microscope slide | Bioland Scientific LLC | 7105P | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854 | |
| Incubator | Keelrein | PH-140(A) | |
| M.marinum | ATCC BAA-535 | ||
| Microinjection needle | World Precision Instruments | IB100F-4 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| msp12:cerulean | Ref.: PMID 25470057; 27760340 | ||
| Phenol red | Sigma | P3532 | |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Single concavity glass microscope slide | Sail Brand | 7103 | |
| Sonicator | SCICNTZ | JY92-IIDN | |
| Spectrophotometer (OD600) | Eppendorf AG | 22331 Hamburg | |
| Stereo Microscope | OLYMPUS | SZX10 | |
| Tg(mfap4:eGFP) | Ref.: PMID 30742890 | ||
| Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) | Ref.: PMID 31278008 | ||
| Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) | Ref.: PMID 27424497; 17477879 |
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