Visualizzazione della morte delle cellule litiche macrofaschi durante l'infezione micobatterica negli embrioni di pesce zebra tramite la microscopia intravitale
Summary
Questo protocollo descrive una tecnica per visualizzare il comportamento dei macrofagi e la morte nel pesce zebra embrionale durante l’infezione da Mycobacterium marinum. Sono inclusi i passaggi per la preparazione di batteri, l’infezione degli embrioni e la microscopia intravitale. Questa tecnica può essere applicata all’osservazione del comportamento cellulare e della morte in scenari simili che coinvolgono l’infezione o l’infiammazione sterile.
Abstract
Il pesce zebra è un eccellente organismo modello per studiare il comportamento delle cellule immunitarie innate a causa della sua natura trasparente e della dipendenza esclusivamente dal suo sistema immunitario innato durante lo sviluppo precoce. Il modello di infezione mycobacterium di zebre Mycobacterium (M. marinum) è stato ben consolidato nello studio della risposta immunitaria dell’ospite contro l’infezione micobatterica. È stato suggerito che diversi tipi di morte delle cellule macrofafie porteranno ai diversi esiti dell’infezione micobatterica. Qui descriviamo un protocollo che utilizza la microscopia intravitale per osservare la morte delle cellule di macrofaci oinfari negli embrioni di pesce zebra in seguito all’infezione da M. marinum. Le linee transgeniche di pesce zebra che etichettano specificamente i macrofagi e i neutrofili sono infettate mediante microiniezione intramuscolare di M. marinum fluorescente nel midbrain o nel tronco. Gli embrioni di pesce zebra infetti vengono successivamente montati su agarose a bassa fusione e osservati dalla microscopia confocale nelle dimensioni X-Y-Z-T. Poiché l’imaging dal vivo a lungo termine richiede l’utilizzo di bassa potenza laser per evitare la fotosbiancamento e la fototossicità, è altamente raccomandato un’espressione forte di transgenici. Questo protocollo facilita la visualizzazione dei processi dinamici in vivo, tra cui la migrazione delle cellule immunitarie, l’interazione con il patogeno ospite e la morte cellulare.
Introduction
L’infezione micobatterica è stata dimostrata per causare la morte delle cellule immunitariedell’ospite 1. Ad esempio, un ceppo attenuato attiverà l’apoptosi nei macrofagi e conterrà l’infezione. Tuttavia, un ceppo virulento attiverà la morte delle cellule littiche, causando la diffusione batterica1,2. Considerando l’impatto che questi diversi tipi di morte cellulare hanno sulla risposta anti-micobatterica dell’ospite, è necessaria un’osservazione dettagliata della morte delle cellule macrofagage durante l’infezione micobatterica in vivo.
I metodi convenzionali per misurare la morte delle cellule sono di utilizzare macchie cellulari morte, come Annnexin V, TUNEL, o acridina arancione / propidio iodide colorazione3,4,5. Tuttavia, questi metodi non sono in grado di far luce sul processo dinamico della morte cellulare in vivo. L’osservazione della morte cellulare in vitro è già stata facilitata dall’imaging vivo6. Tuttavia, se i risultati imitano accuratamente le condizioni fisiologiche rimane poco chiaro.
I pesci zebra sono stati un ottimo modello per studiare le risposte anti-mycobacterio dell’ospite. Ha un sistema immunitario altamente conservato simile a quello degli esseri umani, un genoma facilmente manipolabili, e gli embrioni precoci sono trasparenti, il che consente l’imaging dal vivo7 ,8,9. Dopo l’infezione da M. marinum, il pesce zebra adulto forma strutture di granuloma mature tipiche, e il pesce zebra embrionale forma il granuloma precoce come le strutture9,10. Il processo dinamico di interazione immuno-batteri innato è stato esplorato in precedenza nel modello di infezione da pesce zebra M. marinum 11,12. Tuttavia, a causa dell’elevato requisito di risoluzione spaziale-temporale, i dettagli che circondano la morte delle cellule immunitarie innate rimangono in gran parte indefiniti.
Qui descriviamo come visualizzare il processo di morte delle cellule littiche dei macrofafi innescato dall’infezione micobatterica in vivo. Questo protocollo può essere applicato anche per visualizzare il comportamento cellulare in vivo durante lo sviluppo e l’infiammazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive la visualizzazione della morte dei macrofaghi durante l’infezione micobatterica. Sulla base di fattori come l’integrità della membrana cellulare, l’infezione ha guidato la morte cellulare può essere divisa in apoptosi e morte delle cellule litiniche24,25. La morte delle cellule littiche è più stressante per l’organismo rispetto all’apoptosi, perché innesca una forte risposta infiammatoria 24,<sup …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. eilong Wen per aver condiviso ceppi di pesce zebra, il Dr. Stefan Oehlers e il Dr. David Tobin per aver condiviso le risorse correlate a M. marinum, Yuepeng He per l’assistenza nella preparazione delle figure. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81801977) (B.Y.), dal Programma di formazione dei giovani eccezionale della Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), dal programma di vela di Shanghai (18YF1420400) (B.Y.) e dal Fondo Aperto del Mercato Chiave di Shanghai (2018KF02) (B.Y.).
Materials
| 0.05% Tween-80 | Sigma | P1379 | |
| 10 mL syringe | Solarbio | YA0552 | |
| 10% OADC | BD | 211886 | |
| 3-aminobenzoic acid | Sigma | E10521 | |
| 5 μm filter | Mille X | SLSV025LS | |
| 50 μl/ml hygromycin | Sangon Biotech | A600230 | |
| 7H10 | BD | 262710 | |
| 7H9 | BD | 262310 | |
| A glass bottom 35 mm dish | In Vitro Scientific | D35-10-0-N | |
| Agarose | Sangon Biotech | A60015 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Enviromental Chamber | Pecon | temp control 37-2 digital | |
| Eppendorf microloader | Eppendorf | No.5242956003 | |
| Glass microscope slide | Bioland Scientific LLC | 7105P | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854 | |
| Incubator | Keelrein | PH-140(A) | |
| M.marinum | ATCC BAA-535 | ||
| Microinjection needle | World Precision Instruments | IB100F-4 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| msp12:cerulean | Ref.: PMID 25470057; 27760340 | ||
| Phenol red | Sigma | P3532 | |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Single concavity glass microscope slide | Sail Brand | 7103 | |
| Sonicator | SCICNTZ | JY92-IIDN | |
| Spectrophotometer (OD600) | Eppendorf AG | 22331 Hamburg | |
| Stereo Microscope | OLYMPUS | SZX10 | |
| Tg(mfap4:eGFP) | Ref.: PMID 30742890 | ||
| Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) | Ref.: PMID 31278008 | ||
| Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) | Ref.: PMID 27424497; 17477879 |
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