Visualização da morte de células ticas de macrófago durante infecção micobacteriana em embriões de zebrafish via microscopia intravital
Summary
Este protocolo descreve uma técnica para visualizar o comportamento do macrófago e a morte no zebrafish embrionário durante a infecção do marinum de Mycobacterium. Etapas para a preparação de bactérias, infecção dos embriões e microscopia intravital estão incluídas. Esta técnica pode ser aplicada à observação do comportamento celular e da morte em cenários semelhantes envolvendo infecção ou inflamação estéril.
Abstract
Zebrafish é um excelente organismo modelo para estudar o comportamento inato das células imunes devido à sua natureza transparente e dependência exclusivamente em seu sistema imunológico inato durante o desenvolvimento precoce. O modelo de infecção por Zebrafish Mycobacterium marinum (M. marinum)foi bem estabelecido no estudo da resposta imune do hospedeiro contra a infecção micobacteriana. Tem sido sugerido que diferentes tipos de morte de células de macrófago levará aos diversos resultados da infecção micobacteriana. Aqui descrevemos um protocolo usando microscopia intravital para observar a morte celular de macrófagos em embriões de zebrafish após a infecção por M. marinum. Linhas transgênicas de zebrafish que rotulam especificamente macrófagos e neutrófilos estão infectadas por meio de microinjeção intramuscular de M. marinum com rótulo fluorescente no meio do cérebro ou no tronco. Embriões de zebrafish infectados são posteriormente montados em baixa agarose de fusão e observados pela microscopia confocal nas dimensões X-Y-Z-T. Como a imagem ao vivo a longo prazo requer o uso de baixa potência a laser para evitar o fotobranqueamento e a fototoxicidade, um transgênico fortemente expressor é altamente recomendado. Este protocolo facilita a visualização dos processos dinâmicos in vivo, incluindo a migração de células imunes, interação de patógenos hospedeiros e morte celular.
Introduction
Infecção micobacteriana tem sido demonstrado para causar morte de células imunes hospedeiras1. Por exemplo, uma cepa atenuada irá desencadear apoptose em macrófagos e conter a infecção. No entanto, uma cepa virulenta irá desencadear a morte de células líticas, causando disseminação bacteriana1,2. Considerando o impacto que esses diferentes tipos de morte celular têm na resposta anti-micobacteriana do hospedeiro, é necessária uma observação detalhada da morte de células de macrófago durante a infecção micobacteriana in vivo.
Os métodos convencionais para medir a morte celular são usar manchas de células mortas, como Annnexin V, TUNEL, ou acridina laranja / propidium iodeto manchando3,4,5. No entanto, esses métodos são incapazes de lançar luz sobre o processo dinâmico de morte celular in vivo. A observação da morte celular in vitro já foi facilitada por imagens vivas6. No entanto, se os resultados imitam com precisão as condições fisiológicas ainda não está claro.
Zebrafish tem sido um excelente modelo para estudar host respostas anti-mycobacterium. Tem um sistema imunológico altamente conservado semelhante ao dos seres humanos, um genoma facilmente manipulado, e os embriões iniciais são transparentes, o que permite imagens vivas7,8,9. Após a infecção por M. marinum, zebrafish adulto formam estruturas típicas de granuloma maduro, e zebrafish embrionário formam granuloma precoce como estruturas9,10. O processo dinâmico de interação célula-bactéria imune inata tem sido explorado anteriormente no modelo de infecção por marinum m. marinum 11,12. No entanto, devido à alta exigência de resolução espacial-temporal, os detalhes em torno da morte das células imunes inatas permanecem em grande parte indefinidos.
Aqui descrevemos como visualizar o processo de morte celular lítica de macrófago desencadeada pela infecção micobacteriana in vivo. Este protocolo também pode ser aplicado à visualização do comportamento celular in vivo durante o desenvolvimento e inflamação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve a visualização da morte do macrófago durante a infecção mycobacterial. Com base em fatores como a integridade da membrana celular, a morte celular impulsionada por infecção pode ser dividida em apoptose e morte de células líticas24,25. A morte das células líticas é mais estressante para o organismo do que a apoptose, pois desencadeia uma forte resposta inflamatória 24,25.</s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Zilong Wen por compartilhar cepas de zebrafish, Dr. Stefan Oehlers e Dr. David Tobin por compartilhar recursos relacionados a M. marinum, Yuepeng Ele para assistência na preparação de figuras. Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (81801977) (B.Y.), pelo Outstanding Youth Training Program of Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai Sailing Program (18YF1420400) (B.Y.) e Open Fund of Shanghai Key Laboratory of Tuberculosis (2018KF02) (B.Y.).
Materials
| 0.05% Tween-80 | Sigma | P1379 | |
| 10 mL syringe | Solarbio | YA0552 | |
| 10% OADC | BD | 211886 | |
| 3-aminobenzoic acid | Sigma | E10521 | |
| 5 μm filter | Mille X | SLSV025LS | |
| 50 μl/ml hygromycin | Sangon Biotech | A600230 | |
| 7H10 | BD | 262710 | |
| 7H9 | BD | 262310 | |
| A glass bottom 35 mm dish | In Vitro Scientific | D35-10-0-N | |
| Agarose | Sangon Biotech | A60015 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Enviromental Chamber | Pecon | temp control 37-2 digital | |
| Eppendorf microloader | Eppendorf | No.5242956003 | |
| Glass microscope slide | Bioland Scientific LLC | 7105P | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854 | |
| Incubator | Keelrein | PH-140(A) | |
| M.marinum | ATCC BAA-535 | ||
| Microinjection needle | World Precision Instruments | IB100F-4 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| msp12:cerulean | Ref.: PMID 25470057; 27760340 | ||
| Phenol red | Sigma | P3532 | |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Single concavity glass microscope slide | Sail Brand | 7103 | |
| Sonicator | SCICNTZ | JY92-IIDN | |
| Spectrophotometer (OD600) | Eppendorf AG | 22331 Hamburg | |
| Stereo Microscope | OLYMPUS | SZX10 | |
| Tg(mfap4:eGFP) | Ref.: PMID 30742890 | ||
| Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) | Ref.: PMID 31278008 | ||
| Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) | Ref.: PMID 27424497; 17477879 |
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