Kwantificerende levergrootte bij larvale zebravissen met behulp van Brightfield Microscopie
Summary
Hier demonstreren we een methode voor het kwantificeren van levergrootte bij larve zebravissen, die een manier bieden om de effecten van genetische en farmacologische manipulaties op levergroei en ontwikkeling te beoordelen.
Abstract
In verschillende transgene zebravismodellen van hepatocellulair carcinoma (HCC) kunnen hepatomegaly worden waargenomen tijdens vroege larvestadia. Het kwantificeren van de larve levergrootte bij zebravis HCC-modellen biedt een middel om snel de effecten van geneesmiddelen en andere manipulaties op een oncogene-gerelateerd fenotype te beoordelen. Hier laten we zien hoe ze zebravislarven kunnen fixeren, de weefsels rond de lever ontleden, levers fotograferen met behulp van heldere microscopie, levergebied meten en resultaten analyseren. Dit protocol maakt een snelle, nauwkeurige kwantificering van de levergrootte mogelijk. Aangezien deze methode het meten van levergebied omvat, kan het verschillen in levervolume onderschatten, en de aanvullende methodologieën zijn vereist om tussen veranderingen in celgrootte en veranderingen in celaantal te onderscheiden. De dissectie techniek hierbeschreven is een uitstekend hulpmiddel om de lever, darm en alvleesklier te visualiseren in hun natuurlijke posities voor talloze downstream toepassingen, waaronder immunofluorescentie kleuring en in situ hybridisatie. De beschreven strategie voor het kwantificeren van de grootte van de larvelever is van toepassing op vele aspecten van leverontwikkeling en regeneratie.
Introduction
Hepatocellulair carcinoma (HCC) is de meest voorkomende primaire maligniteit van de lever1 en de derde belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfte2. Om mechanismen van hepatocarcinogenese beter te begrijpen en potentiële HCC-therapieën te identificeren, hebben wij en anderen transgene zebravis ontwikkeld waarin hepatocyte-specifieke expressie van oncogenes zoals β-catenine3,4, Kras(V12)5,6, Myc7of Yap18 leidt tot HCC bij volwassen dieren. Bij deze zebravis wordt leververgroting al op 6 dagen na de bevruchting (dpf) opgemerkt, waardoor een facile-platform wordt geboden voor het testen van de effecten van geneesmiddelen en genetische veranderingen op oncogene aangedreven leverbegroeiing. Nauwkeurige en nauwkeurige meting van de grootte van de larvelever is essentieel voor het bepalen van de effecten van deze manipulaties.
Levergrootte en -vorm kunnen semi-kwantitatief worden beoordeeld in vaste zebravislarven door CY3-SAlabeling 9 of in levende zebravislarven met behulp van hepatocyte-specifieke fluorescerende verslaggevers en fluorescentie ontledenmicroscopie5,6. Deze laatste methode is relatief snel en het gebrek aan precisie kan worden aangepakt door het gebied van elke lever te fotograferen en te meten met behulp van beeldverwerkingssoftware7,10. Het kan echter technisch uitdagend zijn om alle levende larven uniform te positioneren in een experiment zodanig dat tweedimensionaal levergebied een nauwkeurige weergave is van levergrootte. Een soortgelijke techniek voor het kwantificeren van de levergrootte omvat het gebruik van lichtplaatfluorescentiemicroscopie om larve levervolume8te kwantificeren, die nauwkeuriger kan zijn voor het detecteren van grootteverschillen wanneer de lever niet-uniform in verschillende dimensies wordt uitgebreid. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) kan worden gebruikt om het aantal fluorescerende gelabelde hepatocyten en andere leverceltypes in larvelevers8,11te tellen. Bij deze methode worden larvelevers samengevoegd en gescheiden, zodat informatie over individuele levergrootte en -vorm verloren gaat. In combinatie met een andere levergroottebepalingsmethode maakt FACS differentiatie mogelijk tussen verhoogd celgetal (hyperplasie) en verhoogde celgrootte (hypertrofie). Al deze methoden maken gebruik van dure fluorescentietechnologie (microscoop of celsorteerder) en, met uitzondering van CY3-SA-etikettering, vereisen etikettering van hepatocyten met een fluorescerende verslaggever.
Hier beschrijven we in detail een methode voor het kwantificeren van zebravissen larve lever gebied met behulp van bright-field microscopie en beeldverwerking software3,12,13,14. Dit protocol maakt nauwkeurige kwantificering van het gebied van individuele levers ter plaatse mogelijk zonder het gebruik van fluorescentiemicroscopie. Tijdens het analyseren van levergrootte, verblinden we de beeldidentiteit om de vooringenomenheid van onderzoekers te verminderen en wetenschappelijke strengheid te verbeteren15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kwantificering van levergrootte is cruciaal in studies gericht op het begrijpen van leverontwikkeling, regeneratie en oncogenese. Het hier beschreven protocol is een relatief snelle, gemakkelijke en goedkope techniek voor levergroottekwantificering bij larve zebravissen. Het uitoefenen van de nodige voorzichtigheid tijdens het uitvoeren van bepaalde aspecten van het protocol kan helpen bij een grotere nauwkeurigheid van de resultaten en verminderde frustratie.
Een goede fixatie van de larven i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen maurine Hobbs en de Gecentraliseerde Zebrafish Animal Resource (CZAR) aan de Universiteit van Utah erkennen voor het verstrekken van zebravishouderij, laboratoriumruimte en apparatuur om delen van dit onderzoek uit te voeren. Uitbreiding van de CZAR wordt gedeeltelijk ondersteund door NIH grant # 1G20OD018369-01. We willen ook Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum en het Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility bedanken voor de opvang van zebravissen. We willen Kenneth Kompass bedanken voor hulp bij r-programmering. Dit werk werd mede gefinancierd door subsidies van de Huntsman Cancer Foundation (in combinatie met subsidie P30 CA042014 toegekend aan Huntsman Cancer Institute) (KJE) en NIH/NCI R01CA22570 (KJE).
Materials
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
- Lin, D. -. C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Recherche en cancérologie. 77 (9), 2255-2265 (2017).
- Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).
- Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
- Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
- Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
- Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
- Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
- Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
- Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), 21-28 (2012).
- Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Recherche en cancérologie. 77 (6), 1395-1407 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42 (2015).
- Kim, S. -. H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
- Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).
- Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), 1339-1348 (2011).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
