Количественная оценка размера печени в Larval Зебрафиш Использование Brightfield микроскопии
Summary
Здесь мы демонстрируем метод количественной оценки размера печени у личинок зебры, обеспечивая способ оценки влияния генетических и фармакологических манипуляций на рост и развитие печени.
Abstract
В нескольких трансгенных моделях зебры гепатоцеллюлярной карциномы (HCC) гепатомегалия может наблюдаться на ранних личиночных стадиях. Количественная оценка размера личинки печени в моделях HCC зебрафиш обеспечивает возможность быстрой оценки воздействия лекарств и других манипуляций на фенотип, связанный с онкогеном. Здесь мы покажем, как исправить личинки зебры, вскрыть ткани, окружающие печень, фотографировать печень с помощью ярко-поляной микроскопии, измерять область печени и анализировать результаты. Этот протокол обеспечивает быструю и точную количественную оценку размера печени. Поскольку этот метод включает в себя измерение площади печени, он может недооценивать различия в объеме печени, и дополнительные методологии необходимы для различать изменения в размере клеток и изменения в количестве клеток. Техника вскрытия, описанная здесь, является отличным инструментом для визуализации печени, кишечника и поджелудочной железы в их естественных положениях для множества приложений вниз по течению, включая оленивость иммунофлюоресценции и гибридизацию на месте. Описанная стратегия количественной оценки размеров личиночной печени применима ко многим аспектам развития и регенерации печени.
Introduction
Гепатоцеллюлярной карциномы (HCC) является наиболее распространенной первичной злокачественности печени1 и третьей ведущей причиной смертности, связанной с раком2. Чтобы лучше понять механизмы гепатокарциногенеза и определить потенциальные терапии HCC, мы и другие разработали трансгенные зебры, в которых гепатоцитов конкретных выражение онкогенов, таких как з-катенин3,4, Крас (V12)5,6, Myc7, или Yap18 приводит к HCC у взрослых животных. В этих зебры, увеличение печени отмечается уже в 6 дней после оплодотворения (dpf), обеспечивая поверхностную платформу для тестирования воздействия наркотиков и генетических изменений на онкогена инициативе печени разрастание. Точное и точное измерение размера личинки печени имеет важное значение для определения последствий этих манипуляций.
Размер и форма печени могут быть оценены полуколичественно в фиксированных личинок зебры по маркировке CY3-SA9 или в живых личинок зебры с использованием гепатоцитов конкретных флуоресцентных репортеров и флуоресценции вскрытия микроскопии5,6. Последний метод является относительно быстрым, и его отсутствие точности может быть решена путем фотографирования и измерения площади каждой печени с помощью программного обеспечения обработки изображений7,10. Тем не менее, это может быть технически сложным, чтобы равномерно положение всех живых личинок в эксперименте, так что двумерная область печени является точное представление размера печени. Аналогичный метод для количественной оценки размера печени включает в себя использование светлиста флуоресценции микроскопии для количественной личинки печени объем8, которые могут быть более точными для обнаружения различий в размерах, когда печень расширяется неравномерно в различных измерениях. Флуоресценция активированных клеток сортировки (FACS) может быть использован для подсчета числа флуоресцентно помечены гепатоцитов и других типов клеток печени в личиночных печени8,11. При этом методе личиночная печень объединяются и разобщены, поэтому теряется информация об отдельных размерах и форме печени. В сочетании с другим методом определения размера печени, FACS позволяет дифференцировать между увеличением количества клеток (гиперплазия) и увеличение размера клеток (гипертрофия). Все эти методы используют дорогие технологии флуоресценции (микроскоп или сортировка клеток) и, за исключением маркировки CY3-SA, требуют маркировки гепатоцитов флуоресцентным репортером.
Здесь мы подробно описываем метод количественной оценки личинки зебры области печени с использованием ярко-поля микроскопии и обработки изображений программного обеспечения3,12,13,14. Этот протокол позволяет точно определить область отдельных печени на месте без использования флуоресценции микроскопии. При анализе размера печени, мы слепых личности изображения, чтобы уменьшить предвзятость следователя и улучшить научную строгость15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Количественная оценка размера печени имеет решающее значение в исследованиях, направленных на понимание развития печени, регенерации и онкогенеза. Описанный здесь протокол является относительно быстрой, легкой и дешевой техникой количественной оценки размера печени у личинок зебры….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы отметить Моурин Хоббс и централизованный ресурс животных зебрафиш (КЗАР) в Университете штата юта за предоставление зебры, лабораторное пространство и оборудование для проведения части этого исследования. Расширение ЦАР частично поддерживается грантом NIH No 1G20OD018369-01. Мы также хотели бы поблагодарить Родни Стюарт, Хлоя Лим, Лэнс Грэм, Коди Джеймс, Гарретт Никум, и Хантсман институт рака (HCI) Зебрафиш фонда для лечения зебры. Мы хотели бы поблагодарить Кеннета Компасса за помощь в программировании R. Эта работа была частично профинансирована грантами Фонда рака Хантсмана (в сочетании с грантом P30 CA042014, присужденным Институту рака Хантсмана) (KJE) и NIH/NCI R01CA222570 (KJE).
Materials
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
References
- Lin, D. -. C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Recherche en cancérologie. 77 (9), 2255-2265 (2017).
- Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).
- Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
- Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
- Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
- Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
- Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
- Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
- Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), 21-28 (2012).
- Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Recherche en cancérologie. 77 (6), 1395-1407 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42 (2015).
- Kim, S. -. H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
- Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).
- Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), 1339-1348 (2011).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
