Unser experimenteller Ansatz bietet eine Strategie, um Plasmid-Fülle und Antibiotikaresistenz im Laufe der Zeit in Bakterienpopulationen zu folgen.
Plasmide spielen eine wichtige Rolle in der mikrobiellen Ökologie und Evolution als Vehikel des lateralen Gentransfers und Reservoirs von Zubehörgenfunktionen in mikrobiellen Populationen. Dies ist insbesondere in sich schnell verändernden Umgebungen wie schwankenden Antibiotika-Exposition der Fall. Kürzlich haben wir gezeigt, dass Plasmide Antibiotikaresistenzgene in Escherichia coli ohne positive Selektion für die Plasmidpräsenz aufrechterhalten. Hier beschreiben wir ein experimentelles System, das es erlaubt, sowohl dem Plasmidgenotyp als auch dem Phänotyp in Langzeit-Evolutionsexperimenten zu folgen. Wir verwenden molekulare Techniken, um ein Modellplasmid zu entwerfen, das anschließend in einen experimentellen Evolutionsbatch-Systemansatz in einem E. coli-Wirt eingeführt wird. Wir folgen der Plasmidhäufigkeit im Laufe der Zeit, indem wir die Nachbildung der E. coli-Populationen anwenden und gleichzeitig die Persistenz der Antibiotikaresistenz quantifizieren. Darüber hinaus überwachen wir die Konformation von Plasmiden in Wirtszellen, indem wir das Ausmaß der Plasmid-Multimerbildung durch Plasmidnicking und Agarose-Gel-Elektrophorese analysieren. Ein solcher Ansatz ermöglicht es uns, nicht nur die Genomgröße sich entwickelnder Plasmide zu visualisieren, sondern auch deren topologische Konformation – ein Faktor, der für die Plasmidvererbung sehr wichtig ist. Unser System kombiniert molekulare Strategien mit traditionellen mikrobiologischen Ansätzen und bietet eine Einrichtung, um Plasmide in Bakterienpopulationen über einen langen Zeitraum zu verfolgen. Der vorgestellte Ansatz kann in Zukunft angewendet werden, um eine breite Palette mobiler genetischer Elemente zu untersuchen.
Plasmide sind kreisförmige, sich selbst replizierende genetische Elemente, die in Prokaryoten allgegenwärtig sind. Sie sind Erreger des lateralen Gentransfers, da sie Merkmale zwischen mikrobiellen Populationen übertragen können und daher als eine wichtige Rolle in der mikrobiellen Evolution angesehen werden. Plasmide sind Treiber einer schnellen Anpassung an wachstumsbegrenzende Bedingungen über einen kurzen Zeit (z. B. in Gegenwart von Antibiotika oder Pestiziden1) und sind verantwortlich für den langfristigen Übergang zu anderen Lebensstilmodi (z. B. Entstehung von Pathogenität2). Die auffälligsten Beispiele für den Einfluss von Plasmiden auf den Transfer von Genen sind in Ökosystemen dokumentiert, die schwankenden Antibiotikaspiegeln ausgesetzt sind, wie z. B. in medizinischen Kliniken oder in Industriebetrieben3. Aufgrund der starken positiven Selektion kodieren viele Plasmide für antimikrobielle Resistenzgene und werden oft gefunden, um ihrem bakteriellen Wirt Multiresistenz zu verleihen. Plasmide ermöglichen die Migration zwischen Populationen oder Bakterienarten, was zu einer schnellen Ausbreitung mehrerer antimikrobiellen Resistenzen führt. Unter nicht-selektiven Bedingungen sind Plasmide für die Zelle nicht wesentlich und werden oft sogar als parasitäre Elemente bezeichnet. Dennoch sind Plasmide in der Natur allgegenwärtig und ihre Evolution ist stark mit der von bakteriellen Chromosomen verflochten. Plasmid Persistenz in natürlichen Umgebungen (fluktuierend und nicht selektiv) bleibt schlecht verstanden, aber es ist von hoher Bedeutung für unser Verständnis der Persistenz von Antibiotikaresistenz-Genen in der Natur.
Experimentelle Evolution ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von mikrobiellen Populationen4. Die experimentelle Evolution zeigte, dass die Auferlegung einer starken Selektion für die Plasmidpflege zu einer kompensatorischen (d. h. adaptiven) Evolution des Plasmid- oder Wirtschromosoms führt, die die Kosten für die Plasmid-Fitness senkt und wiederum die Plasmid-Fülle (d. h. Plasmidpersistenz)5,6,7erleichtert. So kann nach der Plasmid-Wirt-Interaktion im Laufe der Zeit wichtige Anpassungsmechanismen beider Elemente aufdecken. Darüber hinaus ermöglicht die experimentelle Evolution, die Fülle von Plasmid tragenden Zellen im Laufe der Zeit unter verschiedenen Bedingungen zu quantifizieren8,9,10.
Die Plasmidpersistenz in Evolutionsexperimenten kann durch verschiedene Strategien überwacht werden, einschließlich der Durchflusszytometrie durch fluoreszierende aktivierte Zellsortierung (FACS)11, quantitative PCR (qPCR)11, oder in kultivierungsbasierten Methoden. Die Durchflusszytometrie erfordert eine FACS-Maschine und die Einführung eines nachweisbaren (fluoreszierenden) Markergens, wie z. B. des grünen Fluoreszenzproteins (GFP), auf dem Plasmid. Die GFP-Expression kann jedoch mehrere zelluläre Eigenschaften verändern und darüber hinaus die Plasmidposition in der Zelle12beeinflussen, was wiederum die Plasmidvererbung während der Zellteilung beeinflussen kann. Ein qPCR-Ansatz zur Messung der Plasmid-Fülle kann durch die Plasmid-Kopierzahl stark verzerrt sein, die entlang der bakteriellen Wachstumsphase und im Laufe der Zeit stark variieren kann13. Schließlich erfordert ein kulturbasierter und beschichtungsbasierter Ansatz die Einführung eines wählbaren Markergens. Dies kann ein Antibiotikaresistenzgen sein, das oft auf natürlichen Plasmiden kodiert wird; daher ist keine genetische Manipulation erforderlich. Auf Antibiotikaresistenzen kann ein traditioneller Nachahmungsansatz folgen. Um die natürliche Plasmiddynamik zu untersuchen, eignet sich die Nachbildung der Beschichtung daher gut, um die plasmidcodierte Antibiotika-Resisitance14zu überwachen.
Zur Visualisierung von Plasmidmolekülen (z. B. zur Bewertung der Plasmidgröße) können mehrere Methoden angewendet werden. Ganze Plasmide können mit einem PCR-basierten Ansatz verstärkt werden. Dies erfordert jedoch das Design spezifischer Primer, was während eines Evolutionsexperiments eine Herausforderung sein kann, da sich die Plasmidsequenz im Laufe der Zeit ändern kann. Darüber hinaus ist es aufgrund mehrerer Bindungsstellen für die PCR-Primer schwierig, Plasmidmultimere in einem PCR-basierten Ansatz zu verstärken. Multimeric Plasmidmoleküle können nach der Plasmidreplikationsbeendigung oder durch Rekombination von Plasmidmolekülen auftreten und sind meist von Kopf bis Schwanz15orientiert. Ein anderer Ansatz der Plasmid-Visualisierung kombiniert die enzymatische Verdauung von Plasmidmolekülen durch DNA-Endonukleasen, die einen Plasmid-DNA-Strang entweder spalten oder nicken, mit der Analyse der Agarose-Gel-Elektrophorese. Das gleiche Plasmid unterschiedlicher Größe (z. B. Monomere vs. Multimer) führt zu unterschiedlichen Gelmobilitäten, die bei der Visualisierung der Plasmidmoleküle beobachtet werden können. Dieser Ansatz ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung verschiedener Plasmidkonatationen (d. h. Multimerisierungszustände). Die Plasmidkonformation kann als Indikator für die Plasmidstabilität verwendet werden, da Plasmidmultimere häufig während der Zellteilung verloren gehen16.
In einer kürzlich enden möchteten Arbeit folgten wir der Plasmidpersistenz unter Bedingungen, die nicht selektiv für die Häufigkeit von Plasmiden waren (d.h. ohne Antibiotikaauswahl). Wir verglichen die Plasmidpersistenz bei zwei verschiedenen Temperaturen (20 °C und 37 °C) und drei Populationsgrößen (d. h. Verdünnungsraten). Die Anwendung verschiedener Verdünnungsraten oder Bevölkerungsengpässe ermöglicht die Untersuchung des Einflusses der Populationsgröße auf die bakterielle und Plasmidentwicklung. Basierend auf unseren Ergebnissen schlagen wir vor, dass Plasmide neutral gegenüber ihrem bakteriellen Wirt sein können und Stabilität ohne Selektionsdruck entwickeln können8. Die entwickelte Plasmidstabilität wird durch die Reduktion der Plasmid-Multimerbildung8verliehen.
Hier stellen wir ein Protokoll zur Quantifizierung der Plasmidpersistenz und zur Untersuchung der Plasmidentwicklung im Hinblick auf die Aufrechterhaltung von Antibiotikaresistenzgenen vor. Die Methode hat mehrere Schritte, einschließlich der Einführung eines Antibiotikaresistenzgens in ein Modellplasmid (das bei Verwendung eines natürlichen Resistenzplasmids weggelassen werden kann), gefolgt von der Verwendung experimenteller Evolution, um das Potenzial des Plasmids zu bewerten, unter nicht selektiven Bedingungen bei der Bestimmung der Plasmid-Frequenzdynamik im Laufe der Zeit unter Verwendung der Nachareplikundung und der Analyse des Plasmidgenoms durch Visualisierung. Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um die Evolution und Persistenz von Plasmiden zu untersuchen, aber es kann auch angewendet werden, um die Evolution von Chromosomenresistenzgenen (oder anderen Markergenen) im Laufe der Zeit zu verfolgen.
In diesem Protokoll stellen wir einen Ansatz vor, der Techniken in der Molekularbiologie, experimentelleevolution und DNA-Visualisierung kombiniert, um die Rolle der Plasmid-Evolution für die Persistenz von Antibiotikaresistenzen in Bakterien zu untersuchen. Obwohl der vorgestellte Ansatz Methoden aus verschiedenen Forschungsbereichen kombiniert, sind alle angewandten Techniken einfach und können in einem Standardlabor für Mikrobiologie durchgeführt werden.
Zu den wichtigsten Schritten des Protokolls gehört die Konstruktion des Modellsystemstamms, der die genetische Validierung des Plasmid tragenden Genotyps umfasst. Bemerkenswert ist, dass viele Plasmide auf natürliche Weise Antibiotikaresistenzgene kodieren. So kann der Leser Schritt 1 des Protokolls weglassen und direkt mit Schritt 2 fortfahren. Als nächstes sollten die Evolutionsexperimente ein zufälliges Design von Replizieren von Populationen enthalten, damit die Ergebnisse nicht durch die Position der Repliziertenpopulationen in der Tiefbrunnenplatte verzerrt werden. Darüber hinaus ist es besonders wichtig, die seriellen Übertragungs- und Verdünnungsschritte im Evolutionsexperiment sorgfältig durchzuführen, da eine Kontamination die Ergebnisse verfälschen würde. Schließlich sollte die Nachbildung mit großer Sorgfalt durchgeführt werden. Große Koloniegröße kann ein Problem sein, aber es kann vermieden werden, indem die Platten für weniger als 24 h inkubiert werden. In ähnlicher Weise kann die Anzahl der Kolonien auf einer Platte die Replikationsergebnisse verzerrt. Daher müssen Populationen vor der Beschichtung und Replikation verdünnt werden.
Einer der größten Vorteile unseres Ansatzes ist, dass es ohne schweres Gerät leicht reproduziert werden kann. Darüber hinaus besteht ein weiterer Vorteil der Nachbildung von Markergenen darin, dass nur lebende Zellen ausgewertet werden, im Gegensatz zur Durchflusszytometrie oder qPCR, in der abgestorbene Zellen als lebendig bewertet werden können. So führt die Nachbildung der Beschichtung zu einer geringeren Verzerrung bei der Zählung von Plasmid tragenden Zellen. Eine Einschränkung der Replikbeschichtung kann jedoch die Grundgesamtheitsgröße (d. h. die Zellennummer) sein, die in einem Versuchslauf ausgewertet werden kann.
Mit unserem Ansatz haben wir vor kurzem gezeigt, dass die Evolution der Plasmidstabilität die Persistenz von Antibiotikaresistenzgenen in Bakterien potenziert. So entwickelten wir einen Ansatz als Werkzeug, um Plasmid-vermittelte Resistenz Persistenz zu folgen, die von hoher Bedeutung ist, um Resistenzen im Laufe der Zeit zu folgen, vor allem unter Bedingungen ohne das Vorhandensein von Antibiotika.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Gor Margaryan für die kreative Unterstützung und technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch das ZMB Young Scientist Grant 2017/2018 (an TW verliehen) und das DFG-Schwerpunktprogramm 1819 (Grant-Nr. DA1202/2-1 an TD verliehen).
96-deep-well plates | Starlab | ||
96-deep-well plates | Roth | EN07.1 | 2 ml, square |
96-deep-well plates (cryo) | Starlab | E1702-8400 | Micro-Dilution Tube System |
Colony counter | Stuart | SC6+ | |
Cotton velvet | drapery shop | 100 % cotton required | |
Electrophoresis chamber | BioRad | Agarose gel electrophoresis | |
Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
Electroporation cuvettes | BioRad | 1652089 | 0.1 cm |
Electroporator | BioRad | 1652660 | |
GeneJet Gel Extraction kit | Thermo Fisher Scientific | K0832 | PCR fragment clean-up |
GeneJet Plasmid Miniprep kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Plasmid extraction kit |
Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50125852 | |
Incubator (plate shaker) | Heidolph | 1000 | |
Incubator (shaker) | New Brunswick Scientific | Innova 44 | |
Inoculating loops | Sigma-Aldrich | ||
Multi-channel pippetes | Eppendorf | 3125000052, 3125000028 | |
Multi-channel pippetes | Capp | ME8-1250R | |
NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND2000 | |
Oligonucleotides | Eurofines | ||
Petri dishes | Sigma-Aldrich | ||
Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
Pipettes | Eppendorf | 3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063, | |
PlasmidSafe enzyme | Epicentre | 10059400 | |
Reaction tubes | Eppendorf | 30125150 | |
Replica block & metal ring | VWR | 601-3401 | PVC cylinder 69 mm; ring 102cm |
Resctriction enzymes | New England Biolabs | ||
Thermocycler | BioRad | T100 |