우리의 실험적인 접근은 세균성 인구에 있는 plasmid 풍부하고 항생 저항을 시간이 지남에 따라 전략을 제공합니다.
플라스미드는 미생물 집단에서 부속 유전자 기능의 측면 유전자 전달 및 저수지의 차량으로서 미생물 생태학 및 진화에 중요한 역할을 합니다. 이것은 특히 변화하는 항생제 노출과 같은 급변하는 환경에서 그렇습니다. 우리는 최근에 플라스미드가 플라스미드 존재에 대한 긍정적 인 선택없이 대장균에서 항생 저항 유전자를 유지하는 것으로 나타났습니다. 여기에서 우리는 장기 적인 진화 실험에 있는 plasmid 유전자형 및 표현형을 둘 다 따르는 것을 허용하는 실험 시스템을 기술합니다. 우리는 분자 기술을 사용하여 대장균 숙주에서 실험적 진화 배치 시스템 접근법에 도입되는 모델 플라스미드를 설계합니다. 우리는 항생 저항 지속성을 정량화하는 동안 대장균 인구의 복제 도금을 적용하여 시간이 지남에 따라 플라스미드 주파수를 따릅니다. 또한, 우리는 플라스미드 니킹 및 아가로즈 겔 전기 영동에 의한 플라스미드 다중체 형성의 정도를 분석하여 숙주 세포에서 플라스미드의 형태를 모니터링합니다. 이러한 접근법을 통해 우리는 진화하는 플라스미드의 게놈 크기뿐만 아니라 플라스미드 상속에 매우 중요한 위상적 형태인 위상을 시각화할 수 있습니다. 우리의 시스템은 전통적인 미생물학 접근과 분자 전략을 결합하고 오랜 시간 동안 세균 성 인구에 있는 plasmids를 따르기 위하여 설치를 제공합니다. 제시된 접근법은 미래에 광범위한 모바일 유전 적 요소를 연구하기 위해 적용될 수 있다.
플라스미드는 원핵생물에서 유비쿼터스인 원형의 자가 복제 유전 적 요소입니다. 그(것)들은 미생물 인구 사이 특료를 전송할 수 있기 때문에, 측량 유전자 전송의 에이전트이고, 따라서 미생물 진화에 있는 중요한 역할을 하기 위하여 여겨져 있습니다. 플라스미드는 단시간에 걸쳐 성장을 제한하는 조건에 대한 신속한 적응의 동인(예를 들어, 항생제 또는 살충제1의존재) 및 다른 라이프스타일 모드로의 장기적인 전환(예를 들어, 병원성2의출현)에 대한 책임이 있다. 유전자의 전송에 플라스미드의 충격에 대한 가장 눈에 띄는 예는 의료 진료소 또는 산업 농장에서 와 같은 항생제의 변동 수준에 노출된 생태계에서 문서화됩니다3. 강한 긍정적인 선택 때문에, 많은 플라스미드는 항균 저항 유전자를 위한 인코딩하고 수시로 그들의 세균성 호스트에 다중 저항을 부여하는 것을 발견됩니다. 플라스미드는 인구 또는 세균 종 간의 이동을 가능하게 하여 다중 항균 저항성의 급속한 전파를 초래합니다. 비선택적 조건하에서 플라스미드는 세포에 필수적이지 않으며 종종 기생 요소라고도 합니다. 그럼에도 불구하고, 플라스미드는 본질적으로 유비쿼터스이며 그 진화는 세균 성 염색체의 그것과 매우 얽혀 있습니다. 자연 환경 (변동 및 비 선택적)에서 플라스미드 지속성은 제대로 이해되지 않지만, 본질적으로 항생제 내성 유전자의 지속성에 대한 우리의 이해를 위해 매우 중요합니다.
실험적 진화는 미생물 집단의 연구를 위한 강력한도구입니다 4. 실험적 진화는 플라스미드 유지보수에 대한 강력한 선택을 부과하면 플라스미드 적당 비용을 감소시키는 플라스미드 또는 숙주 염색체의 보상(즉, 적응형) 진화로 이어지며, 차례로 플라스미드 풍부(즉, 플라스미드 지속성)를 용이하게 한다는 것을입증했다5,6,7. 따라서, 시간이 지남에 따라 플라스미드-숙주 상호작용을 따르는 것은 두 원소의 적응의 중요한 메커니즘을 드러낼 수 있다. 더욱이, 실험적 진화는 다양한 조건 하에서 시간이 지남에 따라 플라스미드 운반 세포의 풍부를 정량화할 수 있게 한다8,9,10.
진화 실험에서 플라스미드 지속성은 형광 활성화 세포 선별(FACS)11,정량적 PCR(qPCR)11,또는 재배 기반 방법에 의한 유세포분석법을 포함한 여러 전략에 의해 모니터링될 수 있다. 유세포측정법은 FACS 기계를 필요로 하며, 플라스미드상에서 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 검출 가능한(형광) 마커 유전자의 도입을 요구한다. 그러나, GFP 발현은 몇몇 세포 속성을 변경하고 또한 세포 분열 도중 플라스미드 상속에 영향을 미칠 수 있는 세포(12)에있는 플라스미드 위치에 영향을 미칠 수 있습니다. 플라스미드 풍부도를 측정하는 qPCR 접근법은 플라스미드 카피 수에 의해 매우 편향될 수 있으며, 이는 세균 성장 단계및 시간이 지남에 따라 크게 달라질 수있다 13. 마지막으로, 배양 기반 및 도금 접근법은 선택 가능한 마커 유전자의 도입을 요구한다. 이것은 종종 자연 플라스미드에 인코딩되는 항생제 내성 유전자일 수 있습니다. 따라서 유전 적 조작이 필요하지 않습니다. 항생 저항은 전통적인 복제 도금 접근에 선행될 수 있습니다. 따라서, 천연 플라스미드 역학을 연구하기 위해, 복제 도금은 플라스미드 인코딩된 항생제 반응성14를모니터링하는데 적합하다.
플라스미드 분자(예를 들어, 플라스미드 크기를 평가하기 위해)를 시각화하기 위해 여러 가지 방법이 적용될 수 있다. 전체 플라스미드는 PCR 기반 접근법을 사용하여 증폭될 수 있습니다. 그러나, 이것은 플라스미드 서열이 시간이 지남에 따라 변경될 수 있기 때문에 진화 실험 중에 어려울 수 있는 특정 프라이머의 설계를 필요로 한다. 또한, PCR 프라이머에 대한 다중 결합 부위로 인해 PCR 기반 접근법에서 플라스미드 멀티머를 증폭시키기가 어렵다. 다중 플라스미드 분자는 플라스미드 복제 종단 또는 플라스미드 분자의 재조합을 통해 나타날 수 있으며 대부분 머리에서꼬리까지 15를지향한다. 플라스미드 시각화의 또 다른 접근법은 아가로스 겔 전기 동공 분석과 플라스미드 DNA 가닥을 갈라지거나 닉하는 DNA endonucleases에 의해 플라스미드 분자의 효소 소화를 결합합니다. 상이한 크기의 동일한 플라스미드(예를 들어, 단량체 대 멀티머)는 플라스미드 분자를 시각화할 때 관찰될 수 있는 상이한 겔 동원을 초래한다. 이 접근 방식을 사용하면 다양한 플라스미드 적합성(즉, 다중화 상태)을 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 플라스미드 형태는 플라스미드 멀티머가 세포분열(16)동안 자주 손실되기 때문에 플라스미드 안정성의 지표로서 사용될 수 있다.
최근 작업에서, 우리는 플라스미드 풍부를 위해 선택적이지 않은 조건에서 플라스미드 지속성을 따랐습니다 (즉, 항생제 선택없이). 우리는 두 개의 서로 다른 온도 (20 ° C 와 37 ° C)와 세 가지 인구 크기 (즉, 희석 속도)에서 플라스미드 지속성을 비교했습니다. 다양한 희석율 또는 인구 병목 현상을 적용하면 박테리아 및 플라스미드 진화에 대한 인구 규모의 영향을 조사할 수 있습니다. 우리의 결과에 따라, 우리는 플라스미드가 세균 성 숙주에게 중립적 일 수 있으며 선택 압력8없이안정성을 진화 시킬 수 있음을 제안합니다. 진화된 플라스미드 안정성은 플라스미드 멀티머 형성8의감소에 의해 부여된다.
여기서, 우리는 항생 저항 유전자의 유지에 관하여 플라스미드 진화의 plasmid 지속성 및 조사의 정량화를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 모델 플라스미드에 항생제 내성 유전자의 삽입을 포함하여 여러 단계를 가지고 있습니다 (자연 저항 플라스미드를 사용할 때 생략 될 수 있음), 플라스미드의 잠재력을 평가하기 위한 실험적 진화의 사용이 뒤따릅니다. 비선택적 조건하에서 복제 도금을 이용하여 시간이 지남에 따라 플라스미드 주파수 역학을 결정하고, 시각화에 의한 플라스미드 게놈의 분석을 수행한다. 여기에서 기술된 프로토콜은 플라스미드의 진화 와 지속성을 조사하기 위하여 디자인되었습니다, 그러나 또한 염색체 저항 유전자의 진화를 따르기 위하여 적용될 수 있습니다 (또는 그밖 마커 유전자) 시간이 지남에 따라.
이 프로토콜에서는, 우리는 박테리아에 있는 항생 저항의 지속성을 위한 plasmid 진화의 역할을 조사하기 위하여 분자 생물학, 실험적인 진화 및 DNA 시각화에 있는 기술을 결합하는 접근을 제시합니다. 제시된 접근은 다른 연구 분야의 방법을 결합하더라도, 모든 적용된 기술은 간단하고 표준 미생물학 실험실에서 수행될 수 있습니다.
프로토콜에서 가장 중요한 단계는 플라스미드 운반 유전자형의 유전적 검증을 포함하는 모델 시스템 균주의 구성을 포함한다. 특히, 많은 플라스미드는 항생제 내성 유전자를 자연적으로 인코딩합니다. 따라서, 판독기는 프로토콜의 1단계를 생략하고 2단계로 직접 진행할 수 있다. 다음으로, 진화 실험은 결과가 깊은 우물 판에 복제 인구의 위치에 의해 편향되지 않도록 복제 인구의 무작위 디자인을 포함해야한다. 또한, 오염이 결과를 위조할 수 있으므로 진화 실험에서 직렬 전달 및 희석 단계를 신중하게 수행하는 것이 특히 중요하다. 마지막으로, 복제 도금은 세심한 주의를 기울여 수행되어야 합니다. 큰 콜로니 크기는 문제가 될 수 있지만, 24 시간 미만에 대한 플레이트를 인큐베이팅하여 피할 수 있습니다. 마찬가지로, 한 플레이트에 있는 콜로니의 수는 복제 도금 결과를 편향시킬 수 있습니다. 따라서 도금 및 복제 전에 인구를 희석해야 합니다.
당사의 접근 방식의 가장 큰 장점 중 하나는 중장비 없이도 쉽게 재현할 수 있다는 것입니다. 또한, 마커 유전자를 따르는 복제 도금의 또 다른 장점은 살아있는 세포만이 평가된다는 것입니다, 죽은 세포가 살아있는 것으로 평가될 수 있는 유세포 측정 또는 qPCR과는 대조적으로. 따라서, 복제 도금은 플라스미드 운반 세포의 계수에 대한 편향을 덜 도입한다. 그럼에도 불구하고, 복제 도금의 한 가지 제한은 하나의 실험 실행에서 평가할 수 있는 집단 크기(즉, 셀 수)일 수 있다.
우리의 접근을 사용하여, 우리는 최근에 플라스미드 안정성 진화가 박테리아에 있는 항생 저항 유전자의 지속성을 약하게 한다는 것을 보여주었습니다. 따라서, 우리는 특히 항생제의 존재없이 조건에서 시간이 지남에 따라 저항을 따르는 것이 매우 중요하다 플라스미드 매개 저항 지속성을 따르는 도구로 접근을 개발했다.
The authors have nothing to disclose.
창의적인 지원과 기술 지원을 해주신 고르 마가리안에게 감사드립니다. 이 작품은 ZMB 젊은 과학자 교부금 에 의해 지원되었다 2017/2018 (TW에 수여) 및 DFG 초점 프로그램 1819 (그랜트 번호. DA1202/2-1은 TD에 수여됩니다.
96-deep-well plates | Starlab | ||
96-deep-well plates | Roth | EN07.1 | 2 ml, square |
96-deep-well plates (cryo) | Starlab | E1702-8400 | Micro-Dilution Tube System |
Colony counter | Stuart | SC6+ | |
Cotton velvet | drapery shop | 100 % cotton required | |
Electrophoresis chamber | BioRad | Agarose gel electrophoresis | |
Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
Electroporation cuvettes | BioRad | 1652089 | 0.1 cm |
Electroporator | BioRad | 1652660 | |
GeneJet Gel Extraction kit | Thermo Fisher Scientific | K0832 | PCR fragment clean-up |
GeneJet Plasmid Miniprep kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Plasmid extraction kit |
Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50125852 | |
Incubator (plate shaker) | Heidolph | 1000 | |
Incubator (shaker) | New Brunswick Scientific | Innova 44 | |
Inoculating loops | Sigma-Aldrich | ||
Multi-channel pippetes | Eppendorf | 3125000052, 3125000028 | |
Multi-channel pippetes | Capp | ME8-1250R | |
NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND2000 | |
Oligonucleotides | Eurofines | ||
Petri dishes | Sigma-Aldrich | ||
Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
Pipettes | Eppendorf | 3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063, | |
PlasmidSafe enzyme | Epicentre | 10059400 | |
Reaction tubes | Eppendorf | 30125150 | |
Replica block & metal ring | VWR | 601-3401 | PVC cylinder 69 mm; ring 102cm |
Resctriction enzymes | New England Biolabs | ||
Thermocycler | BioRad | T100 |