Vår experimentella metod ger en strategi för att följa plasmid överflöd och antibiotikaresistens över tid i bakterie populationer.
Plasmider spelar en viktig roll i mikrobiell ekologi och evolution som fordon i sidled genöverföring och reservoarer av tillbehör gen funktioner i mikrobiella populationer. Detta är särskilt fallet under snabbt föränderliga miljöer som fluktuerande antibiotika exponering. Vi visade nyligen att plasmider upprätthålla antibiotikaresistens gener i Escherichia coli utan positivt val för plasmid närvaro. Här beskriver vi ett experiment system som gör det möjligt att följa både plasmid genotyp och fenotyp i långsiktiga evolution experiment. Vi använder molekylära tekniker för att designa en modell plasmid som sedan introduceras till en experimentell evolution satsvis system strategi i en E. coli värd. Vi följer plasmid frekvens över tid genom att tillämpa replika plätering av E. coli populationer samtidigt kvantifiera antibiotikaresistens uthållighet. Dessutom övervakar vi konformation av plasmider i värdceller genom att analysera omfattningen av plasmid multimer formation av plasmid Hack och agaros gel elektrofores. Ett sådant tillvägagångssätt gör det möjligt för oss att visualisera inte bara genomet storleken på framväxande plasmider utan också deras topologiska konformation-en faktor mycket viktigt för plasmid arv. Vårt system kombinerar molekylära strategier med traditionella mikrobiologiska metoder och ger en uppsättning för att följa plasmider i bakterie populationer under lång tid. Den presenterade metoden kan användas för att studera ett brett spektrum av rörliga genetiska element i framtiden.
Plasmider är cirkulära, självreplikerande genetiska element som är allmänt förekommande i prokaryoter. De är agenter för lateral genöverföring, eftersom de kan överföra drag mellan mikrobiella populationer, och därmed anses spela en viktig roll i mikrobiell evolution. Plasmider är drivkrafter för snabb anpassning till tillväxtbegränsande förhållanden under en kort tid (t. ex. i närvaro av antibiotika eller bekämpningsmedel1) och är ansvariga för långsiktig övergång till andra livsstils lägen (t. ex. uppkomst av patogenicitet2). De mest slående exemplen på effekterna av plasmider på överföring av gener dokumenteras i ekosystem som utsätts för fluktuerande nivåer av antibiotika, såsom medicinska kliniker eller i industriella gårdar3. På grund av starkt positivt urval, många plasmider koda för antimikrobiell resistens gener och ofta finns att ge multiresistens till sin bakterie värd. Plasmider möjliggör migration mellan populationer eller bakteriearter, vilket resulterar i en snabb spridning av multipla antimikrobiell resistens. Under icke-selektiva villkor plasmider är inte avgörande för cellen och är ofta även kallas parasitiska element. Icke desto mindre, plasmider är allmänt förekommande i naturen och deras utveckling är mycket sammanflätade med den av bakteriella kromosomer. Plasmid uthållighet i naturliga miljöer (fluktuerande och nonselective) är fortfarande dåligt förstått, men det är av stor betydelse för vår förståelse av den ihållande antibiotikaresistens gener i naturen.
Experimentell evolution är ett kraftfullt verktyg för studiet av mikrobiella populationer4. Experimentell evolution visade att införande av starkt urval för plasmid underhåll leder till kompenserande (dvs adaptiv) utveckling av plasmid eller värd kromosom som minskar plasmid Fitness kostnad och i sin tur underlättar plasmid överflöd (dvs., plasmid uthållighet)5,6,7. Således, efter plasmid-värd interaktion över tiden kan avslöja viktiga mekanismer för anpassning av båda elementen. Dessutom möjliggör experimentell evolution en att kvantifiera överflödet av plasmid-bärande celler över tiden under olika förhållanden8,9,10.
Plasmid uthållighet i evolution experiment kan övervakas av flera strategier inklusive flödescytometri av fluorescerande aktiverad cell sortering (FACS)11, kvantitativ PCR (qPCR)11, eller i odling-baserade metoder. Flödescytometri kräver en FACS maskin och införandet av en detekterbar (fluorescerande) markörgen, såsom den gröna fluorescerande protein (GFP), på Plasmiden. Emellertid, GFP uttryck kan förändra flera cellulära egenskaper och dessutom påverka plasmid plats i cellen12, som i sin tur kan påverka plasmid arv under celldelning. En qPCR metod för att mäta plasmid överflöd kan vara starkt partisk av plasmid kopia nummer, som kan variera kraftigt längs bakterietillväxt fas och med tiden13. Slutligen kräver en kulturbaserad och pläteringsmetod införandet av en valbar markörgen. Detta kan vara en antibiotikaresistensgen, som ofta kodas på naturliga plasmider; Sålunda, ingen genetisk manipulation är nödvändig. Antibiotikaresistens kan följas av en traditionell replik plätering metod. Således, för att studera naturliga plasmid dynamik, replika plätering är väl lämpad att övervaka plasmid-kodade antibiotika resisitance14.
För att visualisera plasmid-molekyler (t. ex. för att utvärdera plasmid-storlek) kan flera metoder tillämpas. Hela plasmider kan amplifieras med hjälp av en PCR-baserad metod. Detta kräver dock utformningen av specifika primers, vilket kan vara utmanande under en evolution experiment, eftersom plasmid sekvens kan ändras med tiden. Dessutom är det svårt att förstärka plasmid-multimers i en PCR-baserad metod på grund av flera bindnings platser för PCR-primers. Multimeric plasmid molekyler kan visas efter plasmid replikering uppsägning eller genom rekombination av plasmid molekyler och är mestadels orienterade head-to-tail15. En annan metod för plasmid visualisering kombinerar enzymatisk nedbrytning av plasmid molekyler av DNA endonukleases att antingen klyva eller Nick en plasmid DNA-sträng med agaros gel elektrofores analys. Samma plasmid av olika storlekar (t. ex. monomerer kontra multimers) resulterar i olika gel utbyten som kan observeras vid visualisering av plasmid molekyler. Detta tillvägagångssätt möjliggör visualisering och kvantifiering av olika plasmid-konformationer (dvs, multimerization stater). Den plasmid konformation kan användas som en indikator på plasmid stabilitet, som plasmid multimers är ofta förlorade under cell Division16.
I ett nyligen arbete, vi följde plasmid uthållighet under förhållanden som inte var selektiva för plasmid överflöd (dvs., utan antibiotikum urval). Vi jämförde plasmid persistens vid två olika temperaturer (20 ° c och 37 ° c) och tre populations storlekar (dvs. utspädnings frekvenser). Att tillämpa olika utspädnings frekvenser, eller befolknings flaskhalsar, gör det möjligt att utreda hur befolkningsstorleken påverkar bakteriell och plasmid evolution. Baserat på våra resultat föreslår vi att plasmider kan vara neutrala till sin bakterie värd och kan utvecklas stabilitet utan något urvals tryck8. Den utvecklade plasmid stabiliteten ges av minskningen av plasmid multimer formation8.
Här presenterar vi ett protokoll för kvantifiering av plasmid Persistens och utredning av plasmid evolution när det gäller upprätthållandet av antibiotikaresistens gener. Metoden har flera steg, inklusive införandet av en antibiotikaresistensgen till en modell plasmid (som kan utelämnas när du använder en naturlig resistens plasmid), följt av användning av experimentell evolution för att bedöma potentialen i plasmid att kvarstå under icke-selektiva villkor samtidigt bestämma plasmid frekvens dynamik över tid med hjälp av replika plätering, och analys av plasmid genom visualisering. Det protokoll som beskrivs här var utformat för att undersöka utvecklingen och persistens av plasmider, men det kan också tillämpas för att följa utvecklingen av kromosomala resistensgener (eller andra markörgener) över tid.
I detta protokoll presenterar vi ett förhållningssätt som kombinerar tekniker inom molekylärbiologi, experimentell evolution, och DNA-visualisering för att undersöka rollen av plasmid evolution för ihållande antibiotikaresistens hos bakterier. Även om den presenterade metoden kombinerar metoder från olika forskningsområden, är alla tillämpade tekniker enkla och kan utföras i ett standardiserat mikrobiologi laboratorium.
De mest kritiska stegen i protokollet omfattar byggandet av modell systemet stam som omfattar genetisk validering av plasmid bär ande genotyp. Särskilt, många plasmider koda naturligt antibiotikaresistens gener. Därför kan läsaren utelämna steg 1 i protokollet och gå direkt vidare med steg 2. Vidare bör evolutions experimenten innefatta en slumpmässig utformning av replikat populationer så att resultaten inte är partiska av positionen för de replikat populationerna i djup-brunn plattan. Dessutom är det särskilt viktigt att noggrant genomföra seriell överföring och utspädning steg i evolution experiment som kontaminering skulle för falska resultaten. Slutligen bör replika plätering genomföras med stor omsorg. Stor koloni storlek kan vara ett problem, men det kan undvikas genom inkuberande plattorna för mindre än 24 h. På samma sätt kan antalet kolonier på en tallrik bias replika resultat. Därför måste populationer spädas före plätering och replikering.
En av de största fördelarna med vår strategi är att det är enkelt att reproducera utan att behöva ha någon tung utrustning. Dessutom, en annan fördel med replika plätering att följa markör gener är att endast levande celler utvärderas, i motsats till flödescytometri eller qPCR där döda celler kan utvärderas som levande. Sålunda, replika plätering introducerar mindre bias till räkning av plasmid-bärande celler. Icke desto mindre, en begränsning av replika plätering kan vara befolkningsstorlek (dvs., cell nummer) som är möjligt att utvärdera i en experimentell körning.
Med vårt förhållningssätt har vi nyligen visat att plasmid stabilitet evolution potentierar ihållande antibiotikaresistens gener i bakterier. Således utvecklade vi ett tillvägagångssätt som ett verktyg för att följa plasmid-medierad resistens uthållighet som är av stor betydelse för att följa motstånd över tid, särskilt under förhållanden utan närvaro av antibiotika.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar gor Margaryan för kreativt stöd och tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av ZMB Young Scientist Grant 2017/2018 (tilldelas TW) och DFG Focus program 1819 (Grant nr. DA1202/2-1 tilldelas TD).
96-deep-well plates | Starlab | ||
96-deep-well plates | Roth | EN07.1 | 2 ml, square |
96-deep-well plates (cryo) | Starlab | E1702-8400 | Micro-Dilution Tube System |
Colony counter | Stuart | SC6+ | |
Cotton velvet | drapery shop | 100 % cotton required | |
Electrophoresis chamber | BioRad | Agarose gel electrophoresis | |
Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
Electroporation cuvettes | BioRad | 1652089 | 0.1 cm |
Electroporator | BioRad | 1652660 | |
GeneJet Gel Extraction kit | Thermo Fisher Scientific | K0832 | PCR fragment clean-up |
GeneJet Plasmid Miniprep kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Plasmid extraction kit |
Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50125852 | |
Incubator (plate shaker) | Heidolph | 1000 | |
Incubator (shaker) | New Brunswick Scientific | Innova 44 | |
Inoculating loops | Sigma-Aldrich | ||
Multi-channel pippetes | Eppendorf | 3125000052, 3125000028 | |
Multi-channel pippetes | Capp | ME8-1250R | |
NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND2000 | |
Oligonucleotides | Eurofines | ||
Petri dishes | Sigma-Aldrich | ||
Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
Pipettes | Eppendorf | 3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063, | |
PlasmidSafe enzyme | Epicentre | 10059400 | |
Reaction tubes | Eppendorf | 30125150 | |
Replica block & metal ring | VWR | 601-3401 | PVC cylinder 69 mm; ring 102cm |
Resctriction enzymes | New England Biolabs | ||
Thermocycler | BioRad | T100 |