生物材料膜上人与羊角膜内皮细胞层的生长
Summary
该协议描述了从人类或绵羊组织外植植物中建立和生长角膜内皮细胞培养的关键步骤。提出了一种在膜状生物材料上对角膜内皮细胞进行亚培养的方法。
Abstract
角膜内皮细胞培养体在细胞与细胞失去接触后有发生上皮到中皮过渡（EMT）的倾向。EMT对细胞是有害的，因为它降低了细胞形成成熟和功能层的能力。在这里，我们提出了一种建立和亚培养人类和绵羊角膜内皮细胞培养的方法，以尽量减少细胞与细胞接触的损失。角膜内皮/Descemet膜的外部从供体角膜中取走，在允许细胞集体迁移到培养表面的条件下放入组织培养中。一旦文化建立，外植物被转移到新鲜的板块，以启动新的文化。去巴塞II用于轻轻地将细胞团从组织培养板上提起，用于亚培养。使用该协议建立的角膜内皮细胞培养物适用于转移到生物材料膜，以产生组织工程细胞层，用于动物试验中的移植。介绍了一种在组织培养过程中支持生物材料膜的定制装置，并举例说，由一层角膜内皮细胞和胶原蛋白I型膜两侧的角膜基质细胞组成的组织工程移植物。
Introduction
角膜是位于眼睛前面的透明组织。它由三个主要层组成：外表面的上皮层、中间的频闪层和称为角膜内皮的内层。角膜内皮是一个单层细胞，位于称为Descemet膜的基底膜上，通过调节从底层水性幽默进入频闪的液体量来保持角膜的透明度。频闪内过多的液体会导致角膜肿胀、不理想和视力丧失。因此，内皮内皮对维持视力至关重要。
角膜内皮可能由于多种原因（包括衰老、疾病和损伤）而功能失调，目前唯一的治疗是移植手术。在这次手术中，内皮和Descemet的膜从患者的角膜上去除，代之以从供体角膜获得的内皮和Descemet膜的移植物。许多内皮移植物也含有一层薄薄的基质组织，以帮助处理和附着到宿主角膜1。
在全球范围内，移植手术对角膜供体组织的需求大于眼库2所能提供的量。因此，人们一直在推动开发组织工程的角膜内皮移植，可用于缓解这一不足3。其依据是，目前，单个角膜的内皮只能转移到单个患者，但是，如果角膜内皮细胞首先在组织培养的生物材料支架上扩张和生长，它们可用于治疗多个患者。
在组织工程的角膜内皮移植成为外科医生的可行选择之前需要解决的主要挑战包括：（1） 建立扩展高质量角膜内皮细胞和生产成熟和功能性角膜内皮细胞层在体外，和（2）建立技术，在生物材料支架上生长细胞，以产生组织工程移植物，等于或优于目前使用的供体角膜衍生移植物。
角膜内皮细胞在体内具有非常低的增殖潜力，但可以刺激在体外分裂4。然而，他们有强烈的倾向，经历体外上皮到中皮过渡（EMT），这降低了他们的能力，形成一个成熟的，功能内皮层。角膜内皮细胞中EMT的已知诱因包括接触某些生长因子和细胞与细胞接触的丧失5。因此，在亚培养过程中酶分离的角膜内皮细胞培养物几乎是不可避免的，这种变化与EMT相关。在这里，我们提出了一种用于人类或绵羊角膜内皮细胞的细胞培养方法，该方法旨在最大限度地减少在隔离、扩张和亚培养阶段细胞与细胞接触的中断，以降低EMT的可能性。此外，我们演示了如何通过在定制安装装置中生物材料膜两侧生长培养细胞层来生成类似于供体角膜衍生内皮/Descemet 膜/体组织移植物的组织工程移植物。
Protocol
Representative Results
Discussion
与建立和扩大人类角膜内皮细胞相关的一项重大技术挑战是防止EMT在培养物中发生。EMT可以通过细胞与细胞接触的丧失在角膜内皮细胞中触发，然而这些细胞的大多数细胞培养协议在分离和亚培养过程中涉及酶分离到单个细胞。在这里，我们提出了角膜内皮细胞的替代细胞培养方案，将细胞在隔离和亚培养阶段失去接触的风险降至最低。
我们建立角膜内皮?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
感谢诺埃米·加洛尼在编制图7期间给予的帮助。这项工作得到了澳大利亚国家卫生和医学研究委员会（项目赠款1099922）向卫生署提供的项目赠款以及昆士兰眼科基金会提供的补充资金的支持。
Materials
| Attachment factor | Gibco | S006100 | A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C. |
| Bovine pituitary extract | Gibco | 13028014 | A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots. |
| Calcium chloride | Merck | C5670 | Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Centrifuge tube, 50 ml | Labtek | 650.550.050 | |
| Chondroitin sulphate | LKT Laboratories | C2960 | This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Ethanol | Labtek | EA043 | 100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces. |
| Foetal bovine serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.03 | This is a HyClone brand of foetal bovine serum. |
| Coverglass No. 1, Ø 13 mm | Proscitech | G401-13 | Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture. |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride. |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Merck | A8960 | Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Micro-Boyden chamber | CNC Components Pty. Ltd. | Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007 | Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE). |
| O-ring for micro-Boyden chamber | Ludowici Sealing Solutions | RSB012 | Composed of silicon rubber. |
| Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1 | Gibco | 51985-034 | A reduced serum medium containing glutamine. |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride. |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin. |
| Petri dish | Sarstedt | 82.14473.001 | Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections. |
| Tissue culture plate, 24 well | Corning Incorporated | Costar 3524 | A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2. |
| Tissue culture plate, 6 well | Corning Incorporated | Costar 3516 | A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2. |
| TrypLE Select | Gibco | 12563-011 | A 1X enzyme solution for dissociating cells. |
| Versene | Gibco | 15040-066 | A 1X EDTA solution for dissociating cells. |
| Watchmaker forceps | Labtek | BWMF4 | Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas. |
References
- Güell, J. L., El Husseiny, M. A., Manero, F., Gris, O., Elies, D. Historical Review and Update of Surgical Treatment for Corneal Endothelial Diseases. Ophthalmology and Therapy. 3, 1-15 (2014).
- Tan, D. T. H., Dart, J. K. G., Holland, E. J., Kinoshita, S. Corneal transplantation. The Lancet. 379 (9827), 1749-1761 (2012).
- Soh, Y. Q., Peh, G. S. L., Mehta, J. S. Translational issues for human corneal endothelial tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regnerative Medicine. 11 (9), 2425-2442 (2017).
- Senoo, T., Joyce, N. C. Cell Cycle Kinetics in Corneal Endothelium from Old and Young Donors. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 41 (3), 660-667 (2000).
- Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Thériault, M., Proulx, S. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 56, 1228-1237 (2015).
- Harkin, D. G., et al. Mounting of Biomaterials for Use in Ophthalmic Cell Therapies. Cell Transplantation. 26 (11), 1717-1732 (2017).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).
- Walshe, J., Harkin, D. G. Serial explant culture provides novel insights into the potential location and phenotype of corneal endothelial progenitor cells. Experimental Eye Research. 127, 9-13 (2014).
- Al Abdulsalam, N. K., Barnett, N. L., Harkin, D. G., Walshe, J. Cultivation of corneal endothelial cells from sheep. Experimental Eye Research. 173, 24-31 (2018).
- Parekh, M., Ferrari, S., Sheridan, C., Kaye, S., Ahmad, S. Concise Review: An Update on the Culture of Human Corneal Endothelial Cells for Transplantation. Stem Cells Translational Medicine. 5 (2), 258-264 (2016).
- Peh, G. S., Toh, K. P., Wu, F. Y., Tan, D. T., Mehta, J. S. Cultivation of human corneal endothelial cells isolated from paired donor corneas. PLoS One. 6 (12), 28310 (2011).
