Groei van menselijke en schapen hoornvlies endotheliale cellagen op biomateriële membranen

Summary

Dit protocol beschrijft de kritieke stappen die nodig zijn om hoornvliesendotheliale celculturen uit explants van menselijk of schapenweefsel vast te stellen en te kweken. Er wordt ook een methode gepresenteerd voor het subculturen van hoornvliescellen op membranous biomaterialen.

Abstract

Hoornvlies endotheelcelculturen hebben de neiging om epitheel-naar-mesenchymale overgang (EMT) te ondergaan na verlies van cel-op-cel contact. EMT is schadelijk voor de cellen omdat het hun vermogen om een volwassen en functionele laag te vormen vermindert. Hier presenteren we een methode voor het vaststellen en subcultureren van menselijke en schapen hoornvlies endotheliale celculturen die het verlies van cel-op-cel contact minimaliseert. Explants van hoornvlies endothehelium / Descemet’s membraan worden genomen uit donorhoornvliezen en geplaatst in weefselcultuur onder omstandigheden die het mogelijk maken de cellen collectief migreren naar het cultuuroppervlak. Zodra een cultuur is vastgesteld, worden de explants overgebracht naar verse platen om nieuwe culturen te initiëren. Dispase II wordt gebruikt om klontjes cellen voorzichtig van weefselkweekplaten te tillen voor subculturing. Hoornvlies endotheelcelculturen die met dit protocol zijn vastgesteld, zijn geschikt voor de overdracht naar biomateriële membranen om weefsel-gemanipuleerde cellagen te produceren voor transplantatie in dierproeven. Een op maat gemaakt apparaat voor de ondersteuning van biomateriële membranen tijdens weefselkweek wordt beschreven en een voorbeeld van een weefsel-engineered graft samengesteld uit een laag hoornvlies endotheelcellen en een laag hoornvlies stromal cellen aan weerszijden van een collageen type I membraan wordt gepresenteerd.

Introduction

Het hoornvlies is een transparant weefsel dat zich aan de voorkant van het oog bevindt. Het bestaat uit drie grote lagen: een epitheellaag op het buitenoppervlak, een middelste stromalaag en een binnenste laag genaamd het hoornvliesendotheel. Het hoornvlies endothehelium is een monolaag van cellen die zit op een kelder membraan genaamd Descemet’s membraan en het handhaaft de transparantie van het hoornvlies door het reguleren van de hoeveelheid vloeistof die de stroma van de onderliggende waterige humor. Te veel vocht in de stroma veroorzaakt hoornvlies zwelling, dekking en verlies van het gezichtsvermogen. Het endotheel is daarom van vitaal belang voor het behoud van visie.

Het hoornvlies endotheel kan disfunctioneel worden om een aantal redenen, waaronder veroudering, ziekte en letsel, en de enige huidige behandeling is transplantatie chirurgie. Tijdens deze operatie worden het endotheel en het membraan van Descemet uit het hoornvlies van de patiënt verwijderd en vervangen door een graft van endotheel en het membraan van Descemet verkregen uit een donorhoornvlies. Veel endotheelgrafts bevatten ook een dunne laag stromal weefsel om de behandeling en gehechtheid aan het gastheerhoornvlies te helpen¹.

Wereldwijd is de vraag naar hoornvliesdonorweefsel voor transplantatieoperaties groter dan het bedrag dat door oogbanken kan worden geleverd². Er is daarom een drive om weefsel-engineered hoornvlies endotheeltransplantaties die kunnen worden gebruikt om dit tekort te verlichten³ontwikkelen. De reden hiervoor is gebaseerd op het feit dat momenteel, endotheel van een individueel hoornvlies kan alleen worden overgedragen aan een enkele patiënt, echter, als het hoornvlies endotheel cellen werden voor het eerst uitgebreid en geteeld op biomateriële steigers in weefselcultuur, ze kunnen worden gebruikt om meerdere patiënten te behandelen.

Grote uitdagingen die moeten worden aangepakt voordat weefsel-engineered hoornvlies endotheeltransplantaties een haalbare optie voor chirurgen worden: (1) het vaststellen van technieken voor het uitbreiden van hoornvlies endotheelcellen van hoge kwaliteit en voor het produceren van volwassen en functionele hoornvlies endotheel cellagen in vitro, en (2) het vaststellen van technieken voor het kweken van de cellen op biomateriële steigers om weefsel-engineered grafts die gelijk zijn aan, of beter dan, de donor hoornvlies-afgeleide grafts die momenteel worden gebruikt te produceren.

Hoornvliesendotheliale cellen hebben een zeer laag proliferative potentieel in vivo, maar kunnen worden gestimuleerd om in vitro te verdelen⁴. Niettemin hebben ze een sterke neiging om in vitro epitheel-naar-mesenchymale overgang (EMT) te ondergaan, wat hun vermogen om een volwassen, functionele endotheellaag te vormen vermindert. Bekende triggers voor EMT in hoornvlies endotheelcellen zijn blootstelling aan bepaalde groeifactoren en verlies van cel-op-cel contact⁵. Het is dus bijna onvermijdelijk dat hoornvliesendotheliale celculturen die enzymatisch gescheiden zijn tijdens de subcultuur veranderingen zullen ondergaan die verband houden met EMT. Hier presenteren we een celkweekmethode voor menselijke of schapen hoornvliesendotheliale cellen die is ontworpen om verstoring van cel-cel-celcontacten tijdens isolatie-, expansie- en subcultuurfasen te minimaliseren, om het potentieel voor EMT te verminderen. Bovendien tonen we aan hoe weefsel-engineered grafts die lijken op donor hoornvlies-afgeleide endotheel / Descemet’s membraan / stromal weefsel grafts kunnen worden geproduceerd door groeiende gekweekte cellagen aan beide zijden van een bio-materiaal membraan in een op maat gemaakte montage-apparaat.

Protocol

Menselijke hoornvliezen met donortoestemming voor onderzoek werden verkregen van de Queensland Eye Bank en gebruikt met ethische goedkeuring van de Metro South Hospital en Health Service’s Human Research Ethics Committee (HREC/07/QPAH/048). Schapen hoornvliezen werden verkregen uit geëuthanaseerde dieren op de Herston Medical Research Facility van de Universiteit van Queensland onder een weefsel delen overeenkomst. 1. Bereiding van hulpmiddelen voor ontleding Steriliseren twee paar …

Representative Results

De methode voor het isoleren en uitbreiden van hoornvliescellen van menselijke of schapenhoornvliezen wordt samengevat in figuur 1 en figuur 2. De meeste explants die zijn afgeleid van de hoornvliezen van 1 tot 2-jarige schapen of menselijke donoren van minder dan 30 jaar oud zal hechten aan Attachment Factor-gecoate weefsel kweekplaten binnen een week, echter, is het niet ongebruikelijk om te vinden dat tot een derde van de explants niet hechten binnen deze tij…

Discussion

Een belangrijke technische uitdaging in verband met het opzetten en uitbreiden van menselijke hoornvlies endotheelcellen is het voorkomen van EMT optreden in de culturen. EMT kan worden geactiveerd in hoornvlies endotheelcellen door verlies van cel-op-cel contact, maar de meeste celkweek protocollen voor deze cellen te betrekken enzymatische dissociatie naar enkele cellen tijdens isolatie en subcultuur¹⁰. Hier presenteren we een alternatief celkweekprotocol voor hoornvliesendotheliale cellen dat h…

Materials

Attachment factor	Gibco	S006100	A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C.
Bovine pituitary extract	Gibco	13028014	A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots.
Calcium chloride	Merck	C5670	Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise.
Centrifuge tube, 50 ml	Labtek	650.550.050
Chondroitin sulphate	LKT Laboratories	C2960	This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Dispase II	Gibco	17105-041	Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Ethanol	Labtek	EA043	100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces.
Foetal bovine serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	This is a HyClone brand of foetal bovine serum.
Coverglass No. 1, Ø 13 mm	Proscitech	G401-13	Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture.
HBSS	Gibco	14025-092	Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride.
L-ascorbic acid 2-phosphate	Merck	A8960	Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise.
Micro-Boyden chamber	CNC Components Pty. Ltd.	Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007	Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE).
O-ring for micro-Boyden chamber	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Composed of silicon rubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	A reduced serum medium containing glutamine.
DPBS	Gibco	14190-144	Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride.
Pen Strep	Gibco	15140-122	A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin.
Petri dish	Sarstedt	82.14473.001	Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections.
Tissue culture plate, 24 well	Corning Incorporated	Costar 3524	A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2.
Tissue culture plate, 6 well	Corning Incorporated	Costar 3516	A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	A 1X enzyme solution for dissociating cells.
Versene	Gibco	15040-066	A 1X EDTA solution for dissociating cells.
Watchmaker forceps	Labtek	BWMF4	Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas.