Crecimiento de capas celulares endoteliales corneales humanas y ovinas en membranas biomateriales
Summary
Este protocolo describe los pasos críticos necesarios para establecer y cultivar cultivos celulares endoteliales corneales a partir de explantas de tejido humano o ovino. También se presenta un método para subculturizar células endoteliales corneales en biomateriales membranosas.
Abstract
Los cultivos de células endoteliales corneales tienden a someterse a una transición epitelial a mesenquimal (EMT) después de la pérdida del contacto entre células. La EMT es perjudicial para las células, ya que reduce su capacidad para formar una capa madura y funcional. Aquí, presentamos un método para establecer y suculcar cultivos celulares endoteliales humanos y ovinos que minimiza nalve la pérdida de contacto de célula a célula. Los explantas de la membrana del endotelio/Descemet se toman de las córneas del donante y se colocan en el cultivo de tejidos en condiciones que permiten que las células migren colectivamente a la superficie de cultivo. Una vez establecida una cultura, los explantes se transfieren a placas nuevas para iniciar nuevos cultivos. Dispase II se utiliza para levantar suavemente los grupos de células de las placas de cultivo de tejido para su subcultura. Los cultivos celulares endoteliales corneales que se han establecido utilizando este protocolo son adecuados para transferir a membranas biomateriales para producir capas celulares de ingeniería tisular para trasplante en ensayos con animales. Se describe un dispositivo hecho a medida para apoyar las membranas biomateriales durante el cultivo del tejido y se presenta un ejemplo de un injerto de ingeniería tisular compuesto por una capa de células endoteliales corneales y una capa de células estromales corneales a ambos lados de una membrana de colágeno tipo I.
Introduction
La córnea es un tejido transparente que se encuentra en la parte delantera del ojo. Se compone de tres capas principales: una capa epitelial en la superficie externa, una capa de estroma medio y una capa interna llamada endotelio corneal. El endotelio corneal es una monocapa de células que se asienta sobre una membrana del sótano llamada membrana de Descemet y mantiene la transparencia de la córnea regulando la cantidad de líquido que entra en el estroma desde el humor acuoso subyacente. El exceso de líquido dentro del estroma causa hinchazón de la córnea, opacidad y pérdida de la visión. Por lo tanto, el endotelio es vital para mantener la visión.
El endotelio corneal puede llegar a ser disfuncional por una serie de razones, incluyendo el envejecimiento, enfermedad y lesión, y el único tratamiento actual es la cirugía de trasplante. Durante esta cirugía, la membrana del endotelio y Descemet se extrae de la córnea del paciente y se reemplaza con un injerto de endotelio y la membrana de Descemet obtenida de una córnea donante. Muchos injertos de endotelio también contienen una fina capa de tejido estroveral para ayudar a la manipulación y fijación a la córnea huésped1.
En todo el mundo, la demanda de tejido de donante corneal para cirugías de trasplante es mayor que la cantidad que pueden ser suministradas por los bancos oculares2. Por lo tanto, ha habido un impulso para desarrollar trasplantes de endotelio corneal de ingeniería de tejido que podrían utilizarse para aliviar este déficit3. La razón de ser de esto se basa en el hecho de que actualmente, el endotelio de una córnea individual sólo puede ser transferido a un solo paciente, sin embargo, si las células endoteliales corneales se expandieron y cultivaron por primera vez en andamios biomateriales en el cultivo de tejidos, podrían ser utilizados para tratar a múltiples pacientes.
Los principales desafíos que deben abordarse antes de que los trasplantes de endotelio corneal con ingeniería de tejido se conviertan en una opción factible para los cirujanos incluyen: (1) establecer técnicas para expandir las células endoteliales corneales de alta calidad y para producir células endoteliales maduras y funcionales capas de células endoteliales corneales in vitro, y (2) establecer técnicas para el cultivo de las células en andamios biomateriales para producir injertos de ingeniería tisular que sean iguales o mejores que los injertos derivados de la córnea del donante que se utilizan actualmente.
Las células endoteliales corneales tienen un potencial proliferativo in vivo muy bajo, pero se pueden estimular para dividir in vitro4. Sin embargo, tienen una fuerte tendencia a someterse a una transición epitelial-mesenquimal (EMT) in vitro, lo que reduce su capacidad para formar una capa endotelial madura y funcional. Los desencadenantes conocidos de la EMT en las células endoteliales corneales incluyen la exposición a ciertos factores de crecimiento y la pérdida del contacto entre células5. Por lo tanto, es casi inevitable que los cultivos celulares endoteliales corneales que se disilizan enzimáticamente durante la subcultura sufren cambios asociados con la EMT. Aquí, presentamos un método de cultivo celular para células endoteliales corneales humanas u ovinas que está diseñado para minimizar la interrupción de los contactos de célula a célula durante las etapas de aislamiento, expansión y subcultivo, para reducir el potencial de EMT. Además, demostramos cómo los injertos de ingeniería tisular que se asemejan a los injertos de endotelio/tejido estrogénico derivados de la córnea de donantes que se asemejan a los injertos de endotelio/tejido estrogénico de descemet pueden ser producidos por el cultivo de capas celulares cultivadas en ambos lados de una membrana biomaterial en un dispositivo de montaje hecho a medida.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un desafío técnico significativo asociado con el establecimiento y la expansión de las células endoteliales corneales humanas es evitar que la EMT ocurra en los cultivos. La EMT se puede activar en las células endoteliales corneales por pérdida de contacto de célula a célula, sin embargo, la mayoría de los protocolos de cultivo celular para estas células implican disociación enzimática a células individuales durante el aislamiento y la subcultura10. Aquí presentamos un protocolo de c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gracias a Noémie Gallorini por su ayuda durante la preparación de la Figura 7. Este trabajo fue apoyado por una subvención de proyecto otorgada a DH por el Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica de Australia (Project Grant 1099922), y por fondos complementarios recibidos de la Queensland Eye Institute Foundation.
Materials
| Attachment factor | Gibco | S006100 | A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C. |
| Bovine pituitary extract | Gibco | 13028014 | A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots. |
| Calcium chloride | Merck | C5670 | Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Centrifuge tube, 50 ml | Labtek | 650.550.050 | |
| Chondroitin sulphate | LKT Laboratories | C2960 | This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Ethanol | Labtek | EA043 | 100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces. |
| Foetal bovine serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.03 | This is a HyClone brand of foetal bovine serum. |
| Coverglass No. 1, Ø 13 mm | Proscitech | G401-13 | Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture. |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride. |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Merck | A8960 | Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Micro-Boyden chamber | CNC Components Pty. Ltd. | Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007 | Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE). |
| O-ring for micro-Boyden chamber | Ludowici Sealing Solutions | RSB012 | Composed of silicon rubber. |
| Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1 | Gibco | 51985-034 | A reduced serum medium containing glutamine. |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride. |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin. |
| Petri dish | Sarstedt | 82.14473.001 | Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections. |
| Tissue culture plate, 24 well | Corning Incorporated | Costar 3524 | A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2. |
| Tissue culture plate, 6 well | Corning Incorporated | Costar 3516 | A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2. |
| TrypLE Select | Gibco | 12563-011 | A 1X enzyme solution for dissociating cells. |
| Versene | Gibco | 15040-066 | A 1X EDTA solution for dissociating cells. |
| Watchmaker forceps | Labtek | BWMF4 | Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas. |
References
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