Ajustement magnétique de l’afterload dans les tissus cardiaques d’ingénierie
Summary
Ce protocole fournit des méthodes détaillées décrivant la fabrication et la mise en œuvre d’une plate-forme d’accordage après la charge magnétique pour les tissus cardiaques conçus.
Abstract
Afterload est connu pour conduire le développement des états cardiaques physiologiques et pathologiques. En tant que tel, l’étude des résultats des états de chargement après modifié pourrait donner un aperçu important des mécanismes de contrôle de ces processus critiques. Cependant, une technique expérimentale pour affiner précisément le chargement de la charge cardiaque au fil du temps fait actuellement défaut. Ici, une technique nouvellement développée basée sur des magnétiques pour réaliser ce contrôle dans les tissus cardiaques machinés (EHT) est décrite. Afin de produire des EHT (MR-EHT) réactifs magnétiquement, les tissus sont montés sur des poteaux en silicone creux, dont certains contiennent de petits aimants permanents. Un deuxième ensemble d’aimants permanents est pressé dans une plaque acrylique de sorte qu’ils sont orientés avec la même polarité et sont axially-alignés avec les aimants de poteau. Pour ajuster après la charge, cette plaque d’aimants est traduite vers (après charge supérieure) ou loin (après charge inférieure) des aimants de poteau utilisant un stade piézoélectrique équipé d’un encoder. Le logiciel de contrôle de mouvement utilisé pour ajuster le positionnement en phase permet le développement de schémas de chargement d’après-dose définis par l’utilisateur, tandis que l’encoder s’assure que l’étape corrige toute incohérence dans son emplacement. Ce travail décrit la fabrication, l’étalonnage et la mise en œuvre de ce système pour permettre le développement de plates-formes similaires dans d’autres laboratoires à travers le monde. Les résultats représentatifs de deux expériences distinctes sont inclus pour illustrer la gamme de différentes études qui peuvent être effectuées à l’aide de ce système.
Introduction
Après charge est la charge systolique sur le ventricule après qu’il a commencé à éjecter le sang1. Pendant le développement cardiaque, une charge après-charge appropriée est d’importance critique pour la maturation cardiomyocyte2. À l’âge adulte, de faibles niveaux de chargement ventriculaire (p. ex., chez les patients alités atteints d’une lésion de la moelle épinière de haut niveau3 ou dans des cas très spéciaux comme le vol spatial4)peuvent entraîner une hypotrophie du cœur. Inversement, la charge après-charge élevée peut mener à l’hypertrophie cardiaque5. Tandis que l’hypertrophie cardiaque dans les athlètes d’endurance ou les femmes enceintes est considérée salutaire et physiologique, l’hypertrophie associée à l’hypertension artérielle à long terme ou la sténose aortique grave de valve est préjudiciable car elle prédispose un aux arythmies cardiaques et à l’insuffisance cardiaque6. Bien que le taux de mortalité sur cinq ans chez les patients souffrant d’insuffisance cardiaque ait diminué de 70 % dans les années 1980de 6 à 40 à 50 %7 actuellement, il y a encore un grand besoin de nouvelles options de traitement thérapeutique pour cette affection très répandue (actuellement 2,2 % de la population dans le monde occidental)8.
Afin d’étudier les mécanismes moléculaires de l’hypertrophie cardiaque pathologique et de tester des stratégies préventives ou thérapeutiques pour le traitement de cette maladie, les modèles in vivo de l’après-charge ont été développés9,10,11,12. Bien que ces modèles aient offert des aperçus bénéfiques des effets de l’après-charge sur les performances ventriculaires, ils ne permettent pas un contrôle fin sur l’ampleur de la charge après la charge. Alternativement, les études in vitro de l’après-charge effectuée sur les cœurs excisés et les préparations musculaires permettent un contrôle plus fin sur le chargement des tissus, mais ces modèles ne sont pas propices aux études longitudinales13,14,15.
Pour surmonter ces problèmes, nous avons développé un modèle in vitro de chargement élevé dans les tissus cardiaques (EHT)16,17. Ce modèle est un format de culture en 3 dimensions pour les cellules cardiaques de rat intégrées dans une matrice de fibrine suspendue entre les poteaux de silicone creux flexibles. Ces tissus battent spontanément (contre la résistance des poteaux en silicone) et effectuent un travail auxotonique. Nous avons augmenté après la charge appliquée aux EHT par un facteur de 12 dans les expériences précédentes par l’insertion d’accolades métalliques rigides dans les poteaux creux de silicone pendant une semaine. Ceci a mené à une multitude de changements, caractéristiques de l’hypertrophie cardiaque pathologique18,19,20: hypertrophie cardiomyocyte, nécroptose partielle, baisse de la force contractile, affaiblissement de la relaxation des tissus, réactivation du programme de gène foetal, changement métabolique de l’oxydation d’acide gras à la glycolyse anaérobie, et une augmentation de la fibrose. Bien que cette procédure a été utilisée avec succès dans plusieurs études17,21,22, il a quelques inconvénients. Il n’y a que deux états, faibles ou très élevés (12 fois) après la charge, et la procédure nécessite une manipulation manuelle des ERE, ce qui limite sa flexibilité temporelle et pose le risque de contamination.
Récemment, Leonard et coll. ont utilisé une technique similaire pour moduler l’après-décharge dans les EHT cultivés sur les poteaux de silicone23. Des accolades de longueurs variables ont été placées autour de l’extérieur des poteaux pour limiter leur mouvement de flexion. Les auteurs de cette étude ont indiqué qu’une augmentation singulière de petite à moyenne de la charge a amélioré le développement et la maturation des EHT humains iPS-dérivés, tandis que des charges plus élevées ont eu comme conséquence un état pathologique. Cependant, semblable à notre propre système, cette technique ne permet que des augmentations singulières de la charge après-charge, dont l’ampleur est dictée par la longueur des accolades. En tant que tel, de fines altérations dans la charge après la charge, des modifications dans l’après-charge au fil du temps, et des régimes de chargement précis ne sont pas possibles avec ces techniques.
Ici, nous fournissons le protocole pour un système qui peut être utilisé pour moduler la post-résistance, c’est-à-dire, après la charge des EHTs magnétiquement24. Cette plate-forme facilite l’ajustement fin de la charge après l’utilisation, permet des schémas de chargement d’après-dose définis par l’utilisateur et assure la stérilité ehT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici décrit une nouvelle technique pour modifier magnétiquement la charge après-charge dans les tissus cardiaques conçus. Cette technique repose sur l’utilisation d’un stade piézoélectrique pour traduire une plaque d’aimants forts vers et loin des supports magnétiquement réactifs de poteaux en silicone. Plus les deux ensembles d’aimants sont proches, plus l’afterload éprouvé par les EHT cultivés sur eux.
Il y a plusieurs étapes qui sont essentielles à…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Jutta Starbatty pour son soutien dans le travail de la culture tissulaire, Axel Kirchhof pour la photographie, Alice Casagrande Cesconetto pour le travail d’édition, et un merci spécial à B’lnt Aksehirlioglu pour le soutien technique dans le développement de ce dispositif. B.B. a été soutenu par un boursier DZHK (Centre allemand de recherche cardiovasculaire), M.L.R. par un Whitaker International Postdoctoral Scholar Grant et M.N.H. par des fonds de la DZHK.
Materials
| Cylindrical plate magnets | HKCM | 9962-55184 | h = 14 mm, d = 13 mm |
| Cylindrical post magnets | HKCM | 9962-63571 | h = 2 mm, d = 0.5 mm |
| Dental wire | Ormco | 266-1316 | d = 0.016 inches (0.406 mm) |
| GraphPad | GraphPad Software, La Jolla, California, USA | version 6.00 for Windows | |
| Motion control software for piezo motor | Micronix USA | free download on manufacturer homepage | |
| Motion controller for piezo motor | Micronix USA | MMC-100-01000 | |
| Optical contractility analysis platform | EHT technologies | A0001 | |
| Piezoelectric linear motor | Micronix USA | PPS-20-15206 | fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible |
| Styrene Rod | Plastruct | MR-15 | d= 0.015 inches (0.381 mm) |
| USB camera | Reichelt Elektronik | REFLECTA 66142 |
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