Regolazione magnetica del postcarico nei tessuti cardiaci ingegnerizzati
Summary
Questo protocollo fornisce metodi dettagliati che descrivono la fabbricazione e l’implementazione di una piattaforma di regolazione del carico di carico magnetica per tessuti cardiaci ingegnerizzati.
Abstract
Il postcarico è noto per guidare lo sviluppo di stati cardiaci fisiologici e patologici. Di conseguenza, lo studio dei risultati degli stati afterload alterati potrebbe fornire importanti informazioni sui meccanismi che controllano questi processi critici. Tuttavia, attualmente manca una tecnica sperimentale per mettere a punto con precisione il post-tuning nel tessuto cardiaco nel tempo. Qui, viene descritta una tecnica basata su magnetici di recente sviluppo per ottenere questo controllo nei tessuti cardiaci ingegnerizzati (EHT). Al fine di produrre EHT magneticamente reattivi (MR-EHT), i tessuti sono montati su pali in silicone cavo, alcuni dei quali contengono piccoli magneti permanenti. Un secondo set di magneti permanenti è press-fit in una piastra acrilica in modo che siano orientati con la stessa polarità e siano assialmente allineati con i magneti del palo. Per regolare il post-carico, questa piastra di magneti viene tradotta verso (dopo il carico superiore) o in trasferta (postcarica inferiore) dai magneti postali utilizzando uno stadio piezoelettrico dotato di un encoder. Il software di controllo del movimento utilizzato per regolare il posizionamento dello stage consente lo sviluppo di regimi post-caricamento definiti dall’utente, mentre l’encoder assicura che lo stage corregge eventuali incoerenze nella sua posizione. Questo lavoro descrive la fabbricazione, la calibrazione e l’implementazione di questo sistema per consentire lo sviluppo di piattaforme simili in altri laboratori in tutto il mondo. I risultati rappresentativi di due esperimenti separati sono inclusi per esemplificare la gamma di diversi studi che possono essere eseguiti utilizzando questo sistema.
Introduction
Il post carico è il carico sistolico sul ventricolo dopo che ha iniziato a espellere il sangue1. Durante lo sviluppo cardiaco, un afterload appropriato è di importanza critica per la maturazione cardiomiocita2. In età adulta, bassi livelli di post-carico ventricolare (ad esempio, in pazienti costretti a letto con lesioni del midollo spinale di alto livello3 o in casi molto particolari come il volo spaziale4)possono provocare ipotrofia del cuore. Al contrario, un elevato afterload può portare all’ipertrofia cardiaca5. Mentre l’ipertrofia cardiaca negli atleti di resistenza o nelle donne in gravidanza è considerata benefica e fisiologica, l’ipertrofia associata all’ipertensione arteriosa a lungo termine o alla grave stenosi della valvola aortica è dannosa in quanto predispone ad aritmie cardiache e insufficienza cardiaca6. Anche se il tasso di mortalità a 5 anni per i pazienti affetti da insufficienza cardiaca si è ridotto dal 70% negli anni ’80dal 6 al 40-50%7 attualmente, c’è ancora un grande bisogno di nuove opzioni terapeutiche per questa condizione altamente prevalente (attualmente 2,2% della popolazione nel mondo occidentale)8.
Al fine di studiare i meccanismi molecolari dell’ipertrofia cardiaca patologica e per testare strategie preventive o terapeutiche per il trattamento di questa malattia, sono stati sviluppati modelli in vivo di postcarico9,10,11,12. Sebbene questi modelli abbiano offerto informazioni utili sugli effetti del postload sulle prestazioni ventricolari, non consentono un controllo preciso sulla magnitudine post-carico. In alternativa, gli studi in vitro del postcarico eseguiti su cuori eccitati e preparati muscolari consentono un controllo più preciso sul carico dei tessuti, ma questi modelli non sono favorevoli agli studi longitudinali13,14,15.
Per superare questi problemi, abbiamo sviluppato un modello in vitro di postload elevato in tessuti cardiaci ingegnerizzati (EHT)16,17. Questo modello è un formato di coltura tridimensionale per le cellule cardiache del ratto incorporate in una matrice di fibrina sospesa tra pali flessibili in silicone cavo. Questi tessuti battono spontaneamente (contro la resistenza dei pali in silicone) ed eseguono un lavoro auxotonico. Abbiamo aumentato il postcarico applicato agli EHT di un fattore 12 negli esperimenti precedenti mediante l’inserimento di bretelle metalliche rigide nei pali in silicone cavo per una settimana. Ciò ha portato a una moltitudine di cambiamenti, caratteristica dell’ipertrofia cardiaca patologica18,19,20: ipertrofia cardiomiocite, necrotosi parziale, un calo della forza contrattile, il compromissione del rilassamento dei tessuti, la riattivazione del programma genico fetale, uno spostamento metabolico dall’ossidazione dell’acido grasso alla glicolisi anaerobica e un aumento della fibrosi. Anche se questa procedura è stata impiegata con successo in diversi studi17,21,22, ha alcuni svantaggi. Ci sono solo due stati, basso o molto alto (12 volte) afterload, e la procedura richiede la gestione manuale degli EHT, che limita la sua flessibilità temporale e pone il rischio di contaminazione.
Recentemente, Leonard ealtri usato una tecnica simile per modulare postload in EHTs coltivati su pali in silicone23. Per limitare il loro movimento di piegatura, sono state posizionate parentesi graffe di lunghezza variabile. Gli autori di questo studio hanno riferito che un singolare aumento di piccole-medie dimensioni dello sviluppo della forza avanzata del carico e della maturazione degli EH di derivazione degli iPO umani, mentre carichi più elevati hanno portato a uno stato patologico. Tuttavia, simile al nostro sistema, questa tecnica consente solo aumenti singolari nel post-caricamento, la cui grandezza è dettata dalla lunghezza delle parentesi graffe. Come tale, le alterazioni fini nel post-caricamento, le modifiche nel postload nel tempo e i regimi di caricamento precisi non sono possibili con queste tecniche.
Qui, forniamo il protocollo per un sistema che può essere utilizzato per modulare la post-resistenza, cioè, dopo il caricamento di EHT magneticamente24. Questa piattaforma facilita la messa a punto del postload, abilita i regimi afterload definiti dall’utente e garantisce la sterilità EHT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto descrive una nuova tecnica per alterare magneticamente il post-carico nei tessuti cardiaci ingegnerizzati. Questa tecnica si basa sull’uso di uno stadio piezoelettrico per tradurre una piastra di forti magneti verso e lontano da rack magneticamente reattivi di pali in silicone. Più i due set di magneti sono vicini, più forte è il postcarico sperimentato dagli EHT coltivati su di essi.
Ci sono diversi passaggi che sono fondamentali per la produzione di successo e …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Jutta Starbatty per il suo sostegno al lavoro di cultura dei tessuti, Axel Kirchhof per la fotografia, Alice Casagrande Cesconetto per il lavoro di editing, e un ringraziamento speciale a B .lent Aksehirlioglu per il supporto tecnico nello sviluppo di questo dispositivo. B.B. è stato sostenuto da un sussidio del Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare, M.L.R. da un Whitaker International Postdoctoral Scholar Grant e M.N.H. da fondi del D.H..
Materials
| Cylindrical plate magnets | HKCM | 9962-55184 | h = 14 mm, d = 13 mm |
| Cylindrical post magnets | HKCM | 9962-63571 | h = 2 mm, d = 0.5 mm |
| Dental wire | Ormco | 266-1316 | d = 0.016 inches (0.406 mm) |
| GraphPad | GraphPad Software, La Jolla, California, USA | version 6.00 for Windows | |
| Motion control software for piezo motor | Micronix USA | free download on manufacturer homepage | |
| Motion controller for piezo motor | Micronix USA | MMC-100-01000 | |
| Optical contractility analysis platform | EHT technologies | A0001 | |
| Piezoelectric linear motor | Micronix USA | PPS-20-15206 | fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible |
| Styrene Rod | Plastruct | MR-15 | d= 0.015 inches (0.381 mm) |
| USB camera | Reichelt Elektronik | REFLECTA 66142 |
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