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Bioengineering

使用无细胞细菌提取物、脂质体和乳液转移制备蛋白质生成合成细胞

Published: April 27, 2020 doi: 10.3791/60829
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,3, 1, 1,3, 1, 1, 1
1Laboratory for Targeted Drug Delivery and Personalized Medicine Technologies, Department of Chemical Engineering, Technion - Israel Institute of Technology, 2The Norman Seiden Multidisciplinary Program for Nanoscience and Nanotechnology, Technion - Israel Institute of Technology, 3The Interdisciplinary Program for Biotechnology, Technion - Israel Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

该协议描述了用于自下而上制备RNA和产生合成细胞的蛋白质的方法、材料、设备和步骤。合成细胞的内水腔含有S30细菌裂解，封装在脂质双层层（即稳定脂质体）内，使用油水乳液转移方法。

Abstract

合成细胞构造的自下而上装配方法是隔离和研究细胞模拟环境中细胞过程的有效工具。此外，无细胞表达系统的发展已经证明了以受控方式重组蛋白质生产、转录和翻译过程（DNA+RNA+蛋白质）的能力，利用合成生物学。在这里，我们描述了一种制备无细胞表达系统的协议，包括生产一种有效的细菌水合物，并将这种水泡封装在富含胆固醇的脂质型巨型单层囊泡（GUVs）（即稳定脂质体）内，以形成合成细胞。该协议描述了合成细胞成分的准备方法，包括活性细菌裂解物的产生，然后根据油水乳液转移方法对合成细胞进行详细的逐步制备。这些有助于以简单和负担得起的方式生产数百万个合成细胞，具有用于生产不同类型的蛋白质的高多功能性。所得合成细胞可用于研究分离环境中的蛋白质/RNA的产生和活性，在定向进化中，以及作为在体内按需生产治疗蛋白的受控药物输送平台。

Introduction

合成细胞是类似细胞的人造粒子，模仿活细胞的一个或多个功能，如分裂、形成膜相互作用和根据遗传代码11、2、32,3合成蛋白质的能力。包含无细胞蛋白合成（CFPS）系统的合成细胞具有很高的模块化，因为它们能够在DNA模板发生改变后产生各种蛋白质和RNA序列。CFPS系统以细胞裂解、纯化成分或合成成分为基础，提供一种有吸引力的替代蛋白，包括蛋白质合成所需的所有转录和翻译机制，如核糖体、RNA聚合酶、氨基酸和能量源（例如，三磷甘油酸盐和三磷酸腺）4、5、6、7、8、9。4,5,6,7,8,9将CFPS系统封装在脂质囊泡内，无需依赖活细胞10即可简单高效地生产蛋白质。此外，该平台允许合成可能在自然细胞内降解的肽，产生对活细胞有毒的蛋白质，以及用非天然氨基酸11，12,12修饰蛋白质。合成细胞已被作为研究目的的模型，研究从进化角度1，13,13实现细胞寿命所需的最小细胞成分。合成细胞也被用来建立和实施遗传回路，并作为定向进化的模型14，15，16。15,1614其他研究的重点是合成细胞模仿自然细胞生物活动的能力，旨在取代受损的自然细胞，如糖尿病患者的β细胞。此外，这些CFPS封装合成细胞产生各种治疗性蛋白质的能力说明了其潜力，被纳入临床使用18。

在这里，我们描述了一个自下而上的实验室规模协议（图1），用于生产基于CFPS系统封装在脂质囊泡中的RNA和产生蛋白质的合成细胞。这表明，合成细胞平台作为新型药物输送系统，用于在体内生产治疗性蛋白质药物的可能性。以前的研究已经研究了CFPS反应和细胞水合制剂过程44，8，208,20的优化。此外，还应用了几种细胞大小的脂质体制备技术，如微流体和聚合物基液滴稳定方法21、22、23，,22,在脂质体脂质组成24、25、2625,26中也有所不同24。23在所介绍的协议中，合成细胞采用水浸液转移法产生，封装过程在低温（<4°C）5、10、24、27、285,10,24,27,28下进行。这些温和的条件被发现有利于保持分子机械的生物功能完整性，即核糖体和蛋白质27，29，30。27,29,30颗粒的脂质组成由胆固醇和1-棕榈-2-奥莱基-sn-糖-3-磷脂素（POPC）组成。第一种存在于所有哺乳动物细胞膜中，对膜的稳定性、刚度和渗透性降低至关重要，后者模仿哺乳动物磷脂成分11、13。11,细胞转录和转化分子机械从BL21（DE3）大肠杆菌（大肠杆菌）菌株中提取，该菌株由pAR1219质粒过度表达T7RNA聚合酶转化，以增加CFPS效力和蛋白质合成。该系统已用于产生诊断和治疗蛋白，31体外和体内19的分子量高达66kDa。以下协议为合成细胞系统的生产提供了一种简单而有效的方法，可以解决与自然界中蛋白质合成相关的广泛基本问题，也可用于药物输送应用。

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Protocol

注：图1中介绍了完整的合成细胞生产协议的图示。根据用户的需求，协议的蛋白质表达（第3.2节）和合成细胞形成（第4节）部分也可以独立进行（进行一些调整）。

1. 制备S30-T7莱沙

  1. 条纹板大肠杆菌BL21（DE3）细菌转化与T7RNA聚合酶表达pAR1219质粒在LB-agar板补充50微克/mL安培霉素，以获得单菌落。
  2. 准备启动溶液：将单个菌体接种成5 mL的LB-media，辅以50μg/mL安培霉素，在100 mL Erlenmeyer烧瓶中，在250 rpm和37°C下使用地板培养振动器过夜生长。准备重复项。
  3. 将每个 5 mL 起动机分别接种到 500 mL 的 TB 介质中，在带挡板的 2 L Erlenmeyer 烧瓶中补充 50 μg/mL 安培霉素，并在 250 rpm 和 37 °C 下使用地板培养振动器生长，直到达到 OD600的 0.8-1。使用分光光度计定期进行监控。
  4. 加入2-3 mL的100 mM库存IPTG（达到0.4 - 0.6 mM）诱导T7RNA聚合酶表达，并继续生长培养，直到它达到OD600+4。
  5. 将溶液从每个 Erlenmeyer 烧瓶转移到两个 250 mL 消毒离心管中。
  6. 在 4 °C 下，在 7，000 x g下各离心 10 分钟。丢弃上清剂。
    注：在此阶段，细菌颗粒可在-20°C下储存几天，然后再进入下一步。
  7. 在 250 mL 的冷 （4°C） S30 液酸液缓冲液中重新悬浮每个颗粒，并在 7，000 x g下以离心机在 4 °C 下 10 分钟。
    注：S30水化液缓冲液用于在步骤1.9中使用均质器进行细胞乳液后维持蛋白质稳定性。从这一步开始，所有步骤，直到1.12应连续和迅速执行。
    注：在继续下一步之前，预冷却存放lysate所需的提示和1.5毫升小瓶
  8. 丢弃上清液，并在 15 mL 的冷 S30 赖沙缓冲液中重新悬浮所有颗粒。使用纱布垫过滤悬架。
    注：15ml溶液是由于均匀最小体积。应该注意，细菌浓度也很重要。
  9. 在工作压力为 15，000 psi 时均质化，空气压力为 4 bar（两次），用于细胞断裂。避免溶液稀释，使更集中和活性的液解水解。
  10. 每 10 mL 均质悬架中加入 100 μL 0.1 M DTT（小心）。
  11. 在 24，700 x g下离心 30 分钟，在 4 °C 下。
  12. 快速执行以下步骤以保持液化活性：将上清液逐个分成 200 μL 等位物，预冷 1.5 mL 小瓶，并立即用液氮卡住冻结它们。储存在-80°C，供进一步使用。
    注意：DTT被归类为刺激和有害，因此应谨慎对待。

2. 油溶液中脂质的制备

  1. 分别溶解氯仿（注意）中的POPC和胆固醇，每个最终浓度为100毫克/mL。涡旋每个小瓶分开。
    1. 将组件组合在 2mL 玻璃小瓶中：在氯仿中加入 50 μL 的 POPC，在氯仿中加入 50 μL 的胆固醇和 500 μL 的矿物油。对于 100 μL 的合成细胞，需要 2 瓶油中的脂质。
    2. 涡旋，然后在化学罩中加热约1小时80°C以蒸发氯仿。按照指定的时间/条件监控溶液体积，确保完全蒸发。
      注：所得脂质油溶液可在室温下储存长达两周。为了改进结果，建议在每次实验之前使用新的制剂。脂质和胆固醇比可根据所需的膜组成而改变。高浓度的胆固醇会导致最终合成细胞溶液中聚集物的形成。
      注意：氯仿被归类为刺激和有害，因此应谨慎对待，并在烟雾提取地区。

3. 外部、内置和进料解决方案的准备

  1. 准备库存解决方案
    1. 使用超纯水 （UPW） 准备表 2中列出的库存解决方案。
      注：库存解决方案应提前准备，并储存在-20°C，直到进一步使用。试剂 7 倾向于形成聚合。加热到37°C将减少聚合。轻微聚合不会对反应产生显著影响。试剂8溶液是乳白色和浑浊的。
  2. 外部解决方案
    1. 将葡萄糖溶解在DNase/无Nase H2O中，最终浓度为200 mM。
    2. 对于 100 μL 的内部溶液，准备 1.6 mL 的外部溶液。
  3. 预内解决方案
    1. 根据表2所列的含量和浓度添加试剂1-14。例如，对于最终合成细胞体积为 100 μL，制备 100 μL 的内部溶液。
      注：应添加 UPW 以完成最终所需的卷。在此阶段，混合物可在4°C下储存几个小时。
  4. 进料解决方案
    1. 根据表 3中列出的数量和浓度添加所有试剂。
      注：使用1：1的比例进给溶液：内部溶液。对于最终合成细胞体积为 100 μL，准备 100 μL 的进料溶液。建议准备少量的外、内和进料溶液。

4. 合成细胞的制备

注：以下体积调整，以制备100μL的合成细胞。

  1. 产生蛋白质的合成细胞
    1. 在 15 mL 管中，放置 12 mL 的外部溶液，并在油溶液中缓慢地在一层上加入 500 μL 的脂质。在室温下孵育20分钟。
    2. 要最终确定内部溶液制备：通过解冻并将S30-T7赖酸（试剂15）和DNA质粒（试剂16）添加到储存的混合物中，将碎冰上的内部溶液成分混合到100μL的最终体积。
    3. 到油溶液中具有500μL脂质的第二个2 mL玻璃小瓶中，加入100μL的内部溶液。上下大力旋转1分钟，在第五级再旋一分钟。
      1. 在碎冰上孵育10分钟，然后缓慢地在15 mL管（从4.1.1起）的油相顶部加入产生的乳液。
    4. 在 100 x g和 4 °C 下离心 10 分钟，然后在 400 x g和 4 °C 下离心 10 分钟。在离心结束时，应观察管底的颗粒。
      注： 使用摆动桶离心转子是这里的首选，以获得更好的覆盖第二层脂质在油中水滴通过相间。如果没有可观测的颗粒，离心速度可提高到1000 x g。否则，请参阅"讨论"部分，其中提到外部解决方案的具体严重性。
    5. 提取颗粒。
      1. 拆下多余的油层。
      2. 使用装有约 400 μL 外溶液的修剪移液器尖端提取颗粒。通过油相时释放外部溶液，以便只收集水相中的颗粒。
        1. 提取颗粒后擦拭尖端，以避免转移油落，并将颗粒转移到干净的 1.5 mL 管中。
    6. 在 1，000 x g和 4 °C 下离心 10 分钟，去除上清液，并在 100 μL 的进料溶液中重新悬浮颗粒（内部：进给溶液的 1：1 比率）。
      注：这里也可以使用固定角度离心转子。
    7. 对于蛋白质表达，在37°C下孵育2小时，不颤抖。
      注：最佳孵育时间因不同蛋白质而异。
    8. 根据目标蛋白特性，使用合适的方法评估产生的蛋白质量。
  2. 推荐的控制组
    1. 内部解决方案和液解酶活性确认
      1. 准备完整的内部溶液（使用DNA和S30-T7液解）。
      2. 在250 rpm的地板培养振动器或1200 rpm的热混合器下，在37°C的恒定温度下，在2小时内，立即孵化上述反应。
        注：调整孵育时间以匹配合成细胞孵育时间。
    2. 合成细胞
      1. 负对照组：准备4.1中提出的协议，内解无DNA。
      2. 正对照：准备4.1中提出的协议，内溶液包含一个T7质粒编码的记者基因。
        注：在测试组旁边添加由报告基因（如 sfGFP）组成的正对照组，以确保封装效率步骤。

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Representative Results

我们提出了一种合成细胞制备协议，通过封装基于BL21大肠杆菌体内脂质囊泡的S30-T7 CFPS系统。图 2中介绍了准备过程的原理图描述，其中包括每个阶段的图像。合成细胞制备过程的成功取决于每个阶段的适当性能，并受不同参数的影响。应调整协议以适应特定蛋白质的产生。

在CFPS散量反应和合成细胞中，将表达模型蛋白超级文件夹绿色荧光蛋白（sfGFP）和雷尼拉荧光酶（Risilla Luciferase）的质粒引入CFPS散装反应和合成细胞，并用不同方法评估蛋白质的产生，包括西方印布、流动细胞学、显微镜和光谱（图3）。图3A对sfGFP-他6标记蛋白（+27 kDa32）的产生进行了验证。稀释6折的合成细胞样本30μL与10μL的普通SDS-PAGE样品缓冲液（含有洗涤剂硫酸钠（SDS）和β-甲醇）混合，煮10分钟（95 oC）。我们发现，样品缓冲液中的热量和洗涤剂的组合足以分解囊泡，并使SDS-PAGE凝胶中的蛋白质能够运行。蛋白质检测使用抗他多克隆原抗体（稀释1：12，000）。正如所料，虽然在含有sfGFP编码DNA模板（"_sfGFP DNA"）的样品中检测到蛋白质生产，但在排除DNA模板的阴性对照样本中，没有观察到任何蛋白质（"-DNA"）。纯化sfGFP和纯化sfGFP的样品封装在合成细胞膜（sfGFP（封装）中，用作sfGFP CFPS批量生产及其合成细胞中的正向控制。该方法可应用于不同的蛋白质类型。据Krinsky等人19日介绍，在CFPS溶液中，在CFPS溶液中获得的sfGFP产量为380微克/升，当CFPS溶液封装在脂质囊泡中时为5.3微克/mL。

当合成细胞内产生的蛋白质是荧光时，可以使用显微镜和流细胞测量方法评估其生产。我们使用荧光显微镜和GFP荧光过滤器对合成细胞进行了分析（图3B）。由于 CFPS 组件具有一些自动荧光，图像采集参数应根据适当的负控制样本（例如，没有 DNA 模板的合成细胞）进行调整。

此外，我们使用流细胞测定法来确定产生sfGFP的合成细胞的平均荧光强度，以及活性合成细胞的百分比，这些细胞可以在它们体内产生蛋白质（图3CI&II）。为每个分析样本收集了 10，000 个事件。该协议中描述的合成细胞生产通常在溶液中产生21-25%的活性，其浓度约为107个合成细胞/mL。图3C II中的"-DNA"样本呈现的轻微荧光强度是由于CFPS反应中不同成分（如S30流水合酸）的自荧光所致。

基于上述方法制备的合成细胞的GFP信号（直径）的代表尺寸分析表明，平均值为2.4±0.5μm（图3D II）。由于该方法中油乳液中水的形成是应用机械力的结果，颗粒的大小分布可能受不同因素的影响，如上下移液的方法和速度、涡流搅拌机的模型等。

为了测试合成细胞蛋白质生产的多功能性，分析了合成细胞内报告蛋白Renilla Luciferase的表达（图3E）。该测定通过测量透明酶及其基质h-coelenterazin酶酶酶酶酶酶酶产生的发光物，量化了雷尼拉荧光酶活性。为了诱导酶反应，在测量前，合成细胞（25μL样品体积）中添加了1μM的h-coelenterazine的最终浓度。"-DNA"样品，不含荧光酶编码DNA模板被用作阴性控制，用于测试由于基质的非酶氧化引起的发光。使用板式读取器测量发光。

Figure 1
图1：典型合成细胞制备协议的流程图。该过程分为两个步骤。第 1 步：实验前准备，包括DNA质粒纯化、S30-T7 液解制备、内和进料溶液所需的库存溶液制备、油脂溶液制备和外部溶液制备。第2步：合成细胞形成，包括喂养和内溶液制备、合成细胞制备和分析。在括号中以蓝色表示制备100 μL合成细胞溶液所需成分的体积示例。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 2
图2：合成细胞制备协议的原理图。执行良好的过程的图像说明了协议的每个阶段。这个数字是从克林斯基等人19号修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 3
图3：合成细胞内sfGFP和雷尼拉透明酶的产生代表性结果。（A） 在 CFPS 大容量反应和合成细胞内部对 sfGFP-His6 的产生进行西方斑点分析。蛋白质检测使用抗他多克隆原抗体（稀释1：12，000）。纯化 sfGFP-His6 用作正控制 （7.8 μg）。sfGFP（封装）是合成细胞中纯化sfGFP的正控制。没有DNA模板的样品被用作生产分析（"-DNA"）的负控制。（B） 使用荧光显微镜与亮场和GFP过滤器采集的sfGFP合成细胞的代表性图像。刻度柱 = 50 μm. （C） I&II 流动细胞学分析 sfGFP 产生合成细胞活性（使用数字 4 激光分析仪收集的数据）。样品在孵育3小时后进行测量。为每个分析样本收集了 10，000 个事件。FSC （500 V） 和 SSC （300 V） 过滤器用于定义总合成细胞填充。然后，使用FITC（600 V）过滤器检测GFP荧光。（I） 活性合成细胞群 [%] 的计算基于 GFP 荧光强度阈值，由"-DNA"样本（红色直方图）定义，允许 ±1% 的错误。（二）产生合成细胞的sfGFP的平均荧光强度。此值从活性合成细胞群计算，并通过将活性合成细胞的平均荧光除以不含 sfGFP-DNA 的合成细胞的平均值来规范化到"-DNA"样本。（D） 合成细胞尺寸分析.对于GFP和明亮场信号，分别检测到505-560nm和642-745nm的发射光谱。（I） 分析合成细胞的代表性图像。（二）合成细胞的大小分布。根据GFP信号进行分析，计算活性合成细胞的直径分布。（E） 合成细胞内活性雷尼拉透明酶的产生.使用板读取器添加1 μM h-coelenterazine后，用发光测量来量化Luciferase活性，并呈现为光强[RLU] x 106。请点击此处查看此图形的较大版本。

表1：缓冲和库存解决方案的准备。
评论
卢里亚·贝尔塔尼 （LB） agar （1.5%）板： 准备和消毒。只有在冷却到室温后，才将最终浓度为 50 μg/mL 的安培霉素加入。
10 克/升巴氏锥形
10 克/升氯化钠 （NaCl）
5 克/升巴托-酵母提取物
15 g/L Agar agar 纯化
50 微克/mL 安皮青素
LB 介质 （20 mL）： 最小的介质。提前准备和消毒。就在接种细菌之前，在最终浓度为50微克/mL时加入安帕西林。
10 克/升巴氏锥形
10 克/升氯化钠 （NaCl）
5 克/升巴托-酵母提取物
50 微克/mL 安皮青素
可怕的肉汤 （TB） 介质 （1 L）： 富媒体。提前准备和消毒。就在接种细菌之前，在最终浓度为50微克/mL时加入安帕西林。
12 克/升巴氏锥形
24 克/升巴托-酵母提取物
4%（v/v）甘油无水
2.32 克/L K2HPO4
12.54 克/L KH2PO4
50 微克/mL 安皮青素
S30 液质缓冲液 （1.5 L）： 提前准备和消毒（*不包括DTT和2-甲酮醇）。储存在-4°C。
10 mM 三酯醋酸酯，pH = 7.4 特里斯马基地
使用醋酸制备和调整pH至7.4。
14 mM 醋酸镁
60 mM醋酸钾
±1 mM DTT 在使用前添加
±0.5 mL/L 2-甲限乙醇 在使用前添加
1 M HEPES-KOH （pH = 8）： 使用 KOH 溶液将 HEPES 溶解到最终浓度为 1 M。 使用 KOH 溶液调整至 pH 8。
赫佩斯
氢氧化钾 （KOH）

   

表 2：内部解决方案组合。
最终请求的内部解决方案卷
数量 试剂 股票公司。 最终和解。 25 μL 50 μL 100 μL 200 μL 300 μL 400 ×我
1 HEPES KOH pH=8 1 米 55 mM 1.375 2.75 5.5 11 16.5 22 前内解决方案
2 醋酸镁 1 米 14 mM 0.35 0.7 1.4 2.8 4.2 5.6
3 醋酸钾 1 米 50 mM 1.25 2.5 5 10 15 20
4 醋酸铵 5.2 米 155 mM 0.75 1.5 3 6 9 12
5 PEG 6000 50% 3% 1.5 3 6 12 18 24
6 3-PGA 0.5 M 40 mM 2 4 8 16 24 32
7 氨基酸 - 混合物I 50 米 2.5 mM 1.25 2.5 5 10 15 20
8 氨基酸 - 混合物 II 50 米 2.5 mM 1.25 2.5 5 10 15 20
9 Atp 100 mM 1.2 mM 0.3 0.6 1.2 2.4 3.6 4.8
10 GTP 50 mM 1 mM 0.5 1 2 4 6 8
11 UTP 100 mM 0.8 mM 0.2 0.4 0.8 1.6 2.4 3.2
12 IPTG 100 mM 1 mM 0.25 0.5 1 2 3 4
13 蔗糖 2 米 200 mM 2.5 5 10 20 30 40
14 ** H2O UPW ** ** ** ** ** **
15 S30-T7 Lysate 34% 8.5 17 34 68 102 136
16 * DNA质粒 10 微克/米L * * * * * *

   

表3：进给溶液组成。
最终请求的进料溶液量
数量 试剂 股票公司。 最终和解。 25 μL 50 μL 100 μL 200 μL 300 μL 400 μL
1 HEPES KOH pH=8 1 米 83.3 mM 2.08 4.17 8.33 16.67 25 33.33
2 醋酸镁 1 米 21.2 mM 0.53 1.06 2.12 4.24 6.36 8.48
3 醋酸钾 1 米 75.5 mM 1.89 3.78 7.55 15.1 22.66 30.2
4 醋酸铵 5.2 米 236.4 mM 1.14 2.27 4.55 9.09 13.64 18.18
5 PEG - 6000 50% 4.54% 2.27 4.54 9.08 18.16 27.24 36.32
6 3-PGA 0.5 M 60.1 mM 3 6.01 12.01 24.02 36.04 48.04
7 氨基酸 - 混合物I 50 mM 3.8 mM 1.89 3.78 7.56 15.12 22.68 30.24
8 氨基酸 - 混合物 II 50 mM 3.8 mM 1.89 3.78 7.56 15.12 22.68 30.24
9 Atp 100 mM 1.8 mM 0.45 0.91 1.81 3.62 5.43 7.24
10 GTP 50 mM 1.5 mM 0.76 1.51 3.02 6.04 9.06 12.08
11 UTP 100 mM 1.2 mM 0.3 0.61 1.21 2.42 3.63 4.84
12 IPTG 100 mM 1.5 mM 0.38 0.76 1.51 3.02 4.53 6.04
13 葡萄糖 2 米 200 mM 2.5 5 10 20 30 40
14 H2O UPW 5.92 11.83 23.7 47.38 71.06 94.76

   

表4：合成细胞制备所需的解决方案。
所需的解决方案和材料 评论
油中的脂质 在室温下存放，直到使用。根据第2节准备
外部解决方案 根据第 3.1 节准备
内部解决方案 根据第3.2节编写。
根据第 4.1 节准备测试和对照样本。
保持碎冰，直到使用。
进料解决方案 根据第3.3节编写。
保持碎冰，直到使用。

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Discussion

该协议引入了一种简单且经济的方法，用于生产大量产生蛋白质的合成细胞。活性细胞的产生取决于谨慎和准确地执行协议，并侧重于几个关键步骤。在该方法的精致部分，在细胞水致之前达到适当的细菌密度，在细菌水致酶中达到足够数量的蛋白质至关重要。其次，在4°C下进行流化过程，用液氮快速冷冻液化酶，以保持蛋白质活性。此外，在该协议中，我们使用大肠杆菌BL21（DE3）细胞与pAR1219质粒表达T7RNA聚合酶。在使用不同的菌株的情况下，可能需要改变裂酶浓度，以达到令人满意的RNA聚合酶和核糖体。即使使用相同的细菌菌株，不同的电解质生产也可能有一些批次到批次的变异性。

囊泡生产部分还包括几个重要步骤。脱脂和去除矿物油中的氯仿对建立油中水乳液具有重要意义。油中水滴离心到外部水缓冲液也是协议中产生具有脂质双层层合成细胞的关键步骤。囊泡和脂质成分的内部溶液变化可能导致油水相间的液滴层，而没有任何可观测的颗粒。为了克服这一点，一个快速的解决方案是在乳液转移步骤中将离心速度提高到1，000 x g。如果这不能解决问题，则可以更改外部水溶液的特定重力，确保内部解具有比外部解更高的特定重力。此外，内部溶液的渗透度可能在不同的水解源和生产之间也有所不同，范围在 800-1100 mOm/kg 之间。内部溶液的熔融性变化主要是由于其生产过程中水化液浓度的变化。通常，这不会导致蛋白质生产的显著变化，但由于裂化剂本身的转录和翻译酶浓度低，大量稀释可能导致产量降低。测量每个液解器批次中的蛋白质总浓度有助于调整内部溶液中的液解液浓度，以保持恒定值（布拉德福德测定测量约22毫克/mL）。

然而，此方法有一些应该提到的限制。并非所有生成的合成细胞都是活性的，并且由于所有所需成分的不完全封装而能够产生蛋白质。我们使用流细胞测定法在生成表达合成细胞的sfGFP时测量了大约21-25%的活性细胞（活性细胞和非活性细胞之间没有观察到显著的大小差异）。合成细胞进入水相后，油和脂质多余的残留物偶尔会留在双层脂质膜中。优化油相中的脂质和胆固醇浓度可以改善这个问题。还必须注意的是，与替代微流体方法相比，获得合成细胞的大小分布相当广泛，囊泡的宽度约为1-50μm。

乳液转移方法的高产，特别适用于合成细胞封装无细胞蛋白合成系统，用于治疗蛋白生产。乳液转移法的不同变化在合成细胞研究中被采用，包括油制备程序、膜组成、样品体积、油内溶液和离心速度5,5、24、28,28的变化。微流体和聚合物基液滴稳定方法也被用于合成细胞制备，然而，整个CFPS系统的封装尚未执行这些方法21，22，23。21,22,23

该方法获得的合成细胞在体内显示产生蛋白质，并在鼠型19中治疗癌症。这些细胞的能力将来可以进一步扩大，超越蛋白质表达。其他细胞过程的整合，如细胞通信、细胞骨架修饰和细胞分裂在合成细胞中，最近被描述为33，34，35，36。33,34,35,36用真核细胞溶酶替代细菌性溶质物将允许表达具有较高复杂性和翻译后修饰的蛋白质，即使没有清洁程序，免疫原性可能也会降低，从而开启更多的治疗前沿。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了ERC-STG-2015-680242的支持。

作者还承认技术综合癌症中心（TICC）的支持;罗素浆果纳米技术研究所;罗瑞一·洛基生命科学与工程跨学科中心;以色列经济部为卡明赠款（52752）;以色列科学技术和空间部首席科学家办公室（3-11878）;以色列科学基金会（1778/13，1421/17）;以色列癌症协会（2015-0116）;德国-以色列科学研究与发展基金会为GIF青年赠款（I-2328-1139.10/2012）;欧洲联盟FP-7职业一体化赠款IRG方案（908049）;磷脂研究中心赠款;罗森布拉特癌症研究基金会，马拉特家庭基金会赠款;和昂格家庭基金会施罗德承认阿隆和陶布奖学金。O. Adir承认谢尔曼和古特维尔斯奖学金。陈承认谢尔曼奖学金。克林斯基感谢罗斯柴尔德·凯撒利亚基金会的阿丽亚娜·德罗斯柴尔德夫人博士计划。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)
E.coli BL21 (DE3)  NEB C2527 E.coli BL21 (DE3).
pAR1219 Sigma T2076 TargeTron vector for transformation.
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin Sigma A9518 Stored at -20 °C.
10 g/L Bacto-tryptone BD Bioscience  211705 For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.
10 g/L Sodium chloride (NaCl) Bio-Lab 19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract BD Bioscience  212750
15 g/L Agar agar purified Merck 1.01614.5007
50 µg/mL Ampicillin Sigma A9518
10 g/L Bacto-tryptone BD Bioscience  211705 For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).
10 g/L Sodium chloride (NaCl) Bio-Lab 19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract BD Bioscience  212750
50 µg/mL Ampicillin Sigma A9518
12 g/L Bacto-tryptone BD Bioscience  211705 For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).
24 g/L Bacto-Yeast extract BD Bioscience  212750
4% (v/v) Glycerol anhydrous Bio-Lab 7120501
2.32 g/L K2HPO4 Spectrum chemical P1383
12.54 g/L KH2PO4 Spectrum chemical P1380
 50 µg/mL Ampicillin Sigma A9518
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  INALCO INA-1758-1400 Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)  TCI D1071 Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 Sigma T1503 S30 lysate buffer (1.5 L)
14 mM magnesium acetate Merck 1.05819.0250
60 mM potassium acetate Carlo Erba 470147
1 mM DTT TCI D1071
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol Sigma M6250
Equipment required for step 1
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks Thermo Scientific 50-154-2846 2 flasks
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles KIMAX-KIMBLE 25630 2 flasks
Floor incubator shaker MRC TOU-120-2 Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
Centrifuge Thermo Scientific 75004270 (75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor.
Should enable at least 13,000 x g.     * Pre-cooled to 4 °C.
High pressure homogenizer AVESTIN EmulsiFlex-C3 Pre-cooled to 4 °C.
-80oC freezer SO-LOW U85-18
Sterilized 1.5 mL plastic tubes Eppendorf 30120086 Preferably pre-cooled to -20 °C.
Spectrophotometer TECAN IN-MNANO Infinite M200 pro
96-well transparent plate Thermo Scientific 167008
Sterilized graduated cylinder Corning
Sterilized centrifuge tubes Eppendorf 30120086 Preferably pre-cooled to -20 °C.
Sterilized pipette tips Corning Preferably pre-cooled to -20 °C.
Crushed ice bucket Bel-Art M18848-4001
Small liquid nitrogen tank NALGENE 4150-4000
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) Lipoid 556400 Powder
Cholesterol Sigma C8667 Powder
Chloroform Bio-Lab 3082301
Mineral oil Sigma M5904 Light oil
Equipment required for step 2
Vortex mixer Scientific industries SI-0256
Heating block TECHNE FDB03AD Pre-heated to 80 °C.
Should enable controlled temperature. 
2 mL screw neck glass vials CSI Analytical Innovations VT009M-1232 For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.
9mm Screw Cap CSI Analytical Innovations C395R-09LC
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):
HEPES Spectrum H1089 1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer
Potassium hydroxide (KOH) Frutarom 55290
1 M Magnesium acetate Merck 1.05819.0250 Co-factor and negative charge stabilizor.
1 M Potassium acetate Carlo Erba 470147 Negative charge stabilizor.
5.2 M Ammonium acetate Merck 1.01116.1000 Stabilizes negative charge.
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) Merck 8.07491.1000 Increases the concentration of the macromolecules.
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) Sigma P8877 Secondary energy source.
50 mM Amino acids mixture I Sigma LAA21-1KT Amino acids additive.
Contains: 50 mM of each of the following 17  natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.
50 mM Amino acids mixture II Sigma LAA21-1KT Amino acids additive.
Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.
100 mM Adenine triphosphate (ATP) Sigma A3377 Nucleotides & energy source.
50 mM Guanidine triphosphate (GTP) Sigma G8877 Nucleotides & energy source.
100 mM Uridine triphosphate (UTP) ACROS ORGANICS 226310010 Nucleotides additive.
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) INALCO INA-1758-1400 Genes expression induction.
2 M Sucrose J.T. Baker 1933078 Generating a density gradient.
2 M Glucose Sigma 16301 Generating a density gradient.
H2O UltraPure Water (UPW) Bio-Lab 2321777500 DNase & RNase free
S30-T7 lysate _ _ Prepared at step 1.                                                                        Source of transcription & translation components.
Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. 
Stock of DNA plasmid of choice _ _ Contains the sequence for the requested protein.
Under T7 promotor
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)
Floor incubator shaker or Thermomixer MRC TOU-120-2 Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
PHMT Grant Bio  PSC18 Thermomixer
Centrifuge Thermo Scientific 75004270 (75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor.
Suited for 15 mL sized tubes.
Preferably swinging buckets.
Should enable at least 1000 x g.
Pre-cooled to 4 °C.
Table centrifuge Thermo Scientific 75002420 (75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal.
Suited for Eppendorf vials.
Pre-cooled to 4 °C.
Vortex mixer Scientific industries SI-0256
Crushed ice bucket Bel-Art M18848-4001
2 mL screw neck glass vials CSI Analytical Innovations VT009M-1232
Sterile 15 mL plastic tubes Thermo Scientific 339651
Sterilized 1.5 mL plastic tubes Eppendorf 30120086
Sterilized pipette tips Corning Sterilized by autoclave.

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References

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使用无细胞细菌提取物、脂质体和乳液转移制备蛋白质生成合成细胞
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Adir, O., Sharf-Pauker, N., Chen, G., Kaduri, M., Krinsky, N., Shainsky-Roitman, J., Shklover, J., Schroeder, A. Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer. J. Vis. Exp. (158), e60829, doi:10.3791/60829 (2020).

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