حية الخلية التصوير من Microtubule Cytoskeleton والتلاعب micromechanical من عربيدوبسيس تبادل لاطلاق النار Apical Meristem
Summary
هنا نحن وصف بروتوكول للتصوير الخلية الحية من القشرية المجهرية cytoskeleton في تبادل لاطلاق النار meristem apical ورصد استجابتها للتغيرات في القوات المادية.
Abstract
وقد فهم الخلايا والأنسجة على مستوى التنظيم للنمو وmorphogenesis في طليعة البحوث البيولوجية لعقود عديدة. سمح لنا التقدم في التقنيات الجزيئية والتصويرية بالحصول على رؤى حول كيفية تأثير الإشارات الكيميائية الحيوية على الأحداث المورفوجينية. ومع ذلك، فمن الواضح بشكل متزايد أنه بصرف النظر عن الإشارات الكيميائية الحيوية، الإشارات الميكانيكية تؤثر أيضا على عدة جوانب من نمو الخلايا والأنسجة. وعربيدوبسيس تبادل لاطلاق النار meristem (SAM) هو هيكل القبة على شكل مسؤول عن توليد جميع الأجهزة فوق الأرض. تنظيم الهيكل الخلوي القشري المجهري الذي يتوسط ترسب السليلوز في الخلايا النباتية هو متميز مكانياً. التصور والتقييم الكمي لأنماط ميكروتوبولس القشرية ضرورية لفهم الطبيعة البيوفيزيائية للخلايا في سام، كما السليلوز هو أشد عنصر من جدار الخلية النباتية. الشكل النمطي لتنظيم ميكروتوبول القشرية هو أيضا نتيجة للقوى المادية على نطاق الأنسجة الموجودة في SAM. إن اجتياز هذه القوى المادية وما يتبعها من رصد لتنظيم ميكروتوبول القشري يسمح بتحديد البروتينات المرشحة المشاركة في التوسط في إدراك mechano وtransduction. هنا نحن وصف بروتوكول يساعد في التحقيق في مثل هذه العمليات.
Introduction
الخلايا النباتية محاطة بمصفوفة خارج الخلية من السكريات والسكريات glycoproteins التي تشبه ميكانيكيا مادة الألياف المركبة المعززة قادرة على تغيير خصائصها الميكانيكية بشكل حيوي1. النمو في الخلايا النباتية هو مدفوع من امتصاص المياه في الخلية، مما يؤدي إلى تراكم متزامن للقوى الشد على جدار الخلية. واستجابة لهذه القوى، فإن التعديلات على الحالة المادية للجدار الخلوي تسمح بتوسيع الخلايا. الخلايا ذات الجدران الأولية قادرة على الخضوع للنمو السريع مقارنة بجدار الخلية الثانوية التي تحتوي على خلايا ويرجع ذلك أساسا إلى الاختلافات في التركيب الكيميائي للبوليسكاريد داخل. تتكون خلايا الجدار الأولية من السليلوز والهيميوللوز والبكتين بالإضافة إلى بروتين الجليكوبروتين، وتفتقر إلى اللجنين، وهو مكون موجود في جدار الخليةالثانوية 2. السليلوز، بوليمر الجلوكوز المرتبطة عبر β-1،4 السندات، هو العنصر الرئيسي من جدران الخلية. يتم تنظيمها في هياكل الفيبريلار التي هي قادرة على تحمل قوى الشد العالية التي شهدتها أثناء نمو الخلايا3. بالإضافة إلى تحمل قوى الشد، يؤدي التعزيز الميكانيكي على طول اتجاه تفضيلي إلى توسع يحركه تورغور على طول محور عمودي على التوجه الصافي للسيليلوز microfibril. ويتأثر تنظيم السليلوز microfibrils من قبل القشرية المجهرية cytoskeleton، لأنها توجه الحركة الاتجاهية للمجمعات السليلوز توليف الموجود في غشاء البلازما4. لذلك ، فإن مراقبة منظمة ميكروتوبول القشرية باستخدام بروتين أو طوبولين مرتبط بالميكروبوليه ، يعمل بمثابة وكيل لمراقبة الأنماط المفرطة للسليلوز في الخلايا النباتية.
نقش الهيكل الخلوي القشري المجهري هو تحت سيطرة الخلايا والأنسجة القوى الميكانيكية المشتقة. لا تملك منظمة microtubule القشرية أي منظمة تفضيلية مع مرور الوقت في الخلايا الموجودة في قمة سام، في حين أن الخلايا في المحيط والحدود بين سام والجهاز الناشئ لديها مجموعة مستقرة، منظمة للغاية فوق الخلوية من microtubules القشرية5. وقد وضعت عدة نهج لانزعاج جسديا الوضع الميكانيكي للخلايا. يمكن أن يؤدي تغيير الحالة التناضحية ، وكذلك العلاج بالمركبات الدوائية والإزيمية التي تؤثر على صلابة جدار الخلية إلى تغييرات لاحقة في قوى الشد التي تعاني منها الخلية6،7. استخدام البدع التي تسمح للزيادة التدريجية في القوى الضغط التي تعاني منها الأنسجة هو بديل آخر8. كما ثبت تطبيق قوات الطرد المركزي للتأثير على القوى الميكانيكية دون أي اتصال مادي مع الخلايا9. ومع ذلك، فإن الوسائل الأكثر استخداما لتغيير قوى الاتجاه في مجموعة من الخلايا الاستفادة من حقيقة أن جميع خلايا البشرة هي تحت التوتر والاستئصال المادي للخلايا سوف القضاء على ضغط تورغور محليا، فضلا عن تعطيل التصاق من خلية إلى خلية، وبالتالي تعديل قوى الشد التي تعاني منها الخلايا المجاورة. ويتم ذلك إما عن طريق استهداف ليزر فوق البنفسجية النبضية عالية الطاقة أو عن طريق إبرة غرامة.
هنا نتوسع في عملية التصوير وتقييم سلوك الميككتوبول القشري للانزعاج الميكانيكي في SAM.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن تقييم أحداث نقل الإشارات الميكانيكية أمر بالغ الأهمية لتحديد المنظمين الجزيئيين المشاركين في إدراك mechano ومسارات النقل. ويوفر البروتوكول الموصوف هنا نظرة كمية لمثل هذه الأحداث باستخدام استجابة ميكروتوبول القشرية كمقرة لمثل هذه العملية في Arabidopsis SAMs. يتم استخدام الإجراء الموضح هنا …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
اي.
Materials
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| micropore tape | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
| myo-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benzyladenine | Sigma | B3408 | |
| nicotinic acid | Sigma | N4126 | |
| plastic hinged box | Electron microscopy sciences | 64312 | |
| PPM (Plant Preservative Mixture) | Plant Cell Technology | PPM | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 |
References
- Cosgrove, D. J. Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly. Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).
- McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. The cell biology of cellulose synthesis. Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).
- Burgert, I. Exploring the micromechanical design of plant cell walls. American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).
- Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules. Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).
- Barbier de Reuille, P., et al. MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D. Elife. 4, 05864 (2015).
- Kierzkowski, D., et al. Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem. Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).
- Heisler, M. G., et al. Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport. PLoS Biology. 8 (10), e1000516 (2010).
- Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline. Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).
- Nakayama, N., et al. Mechanical regulation of auxin-mediated growth. Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).
- Marc, J., et al. A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells. Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).
- Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX. Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks. BMC Biology. 17 (1), 38 (2019).
- Boudaoud, A., et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).
- Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), (2019).
- Hervieux, N., et al. A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis. Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).
- Sampathkumar, A., et al. Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells. Elife. 3, e01967 (2014).
- Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), dev179036 (2019).
- Uyttewaal, M., et al. Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis. Cell. 149 (2), 439-451 (2012).
- Hamant, O., et al. Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis. Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).
