Mikrotübül Sitoiskeletinin Canlı Hücre Görüntülemesi ve Arabidopsis Shoot Apikal Meristem'in Mikromekanik Manipülasyonu
Summary
Burada, ateş apikal meristem’deki kortikal mikrotübül sitoiskeletinin canlı hücre görüntülemesi ve fiziksel kuvvetlerdeki değişikliklere tepkisini izleme protokolünü anlatıyoruz.
Abstract
Büyüme ve morfogenezin hücre ve doku düzeyinde ki düzenlenmesini anlamak uzun yıllardır biyolojik araştırmaların ön saflarında yer almaktadır. Moleküler ve görüntüleme teknolojilerinde ki gelişmeler, biyokimyasal sinyallerin morfogenetik olayları nasıl etkilediğine dair bilgi edinmemizi sağladı. Ancak, biyokimyasal sinyaller dışında, mekanik ipuçları da hücre ve doku büyüme çeşitli yönlerini etkilediği giderek daha belirgindir. Arabidopsis shoot apikal meristem (SAM), tüm yer üstü organlarının oluşumundan sorumlu kubbe şeklinde bir yapıdır. Bitki hücrelerinde apoplastik selüloz birikimine aracılık eden kortikal mikrotübül sitoiskeletinin organizasyonu mekansal olarak farklıdır. Selüloz bitki hücre duvarının en sert bileşeni olduğu için, kortikal mikrotübüllerin desenlerinin görselleştirilmesi ve kantitatif değerlendirilmesi SAM’deki hücrelerin biyofiziksel doğasını anlamak için gereklidir. Kortikal mikrotübül organizasyonunun basmakalıp formu da SAM’de var olan doku çapındaki fiziksel güçlerin bir sonucudur. Bu fiziksel güçlerin pertürbasyonu ve kortikal mikrotübül organizasyonunun daha sonra izlenmesi, mekano algısı ve transdüksiyona aracılık eden aday proteinlerin belirlenmesine olanak sağlar. Burada, bu tür işlemlerin araştırılmasına yardımcı olan bir protokol açıklıyoruz.
Introduction
Bitki hücreleri, mekanik özelliklerini dinamik olarak değiştirebilen fiber takviyeli kompozit malzemeye mekanik olarak benzeyen polisakkaritler ve glikoproteinlerin hücre dışı bir matrisi ile çevrilidir1. Bitki hücrelerindeki büyüme, hücreiçine su alımı ile kaynaklanır, bu da hücre duvarında eşlik eden çekme kuvvetlerinin birikmesine neden olur. Bu tür kuvvetlere yanıt olarak, hücre duvarının fiziksel durumuna değişiklikler hücre genişlemesi için izin verir. Birincil duvarları olan hücreler, esas olarak içindeki polisakkaritlerin kimyasal bileşimindeki farklılıklar nedeniyle hücreleri içeren ikincil hücre duvarına göre hızlı büyüme yeteneğine sahiptir. Birincil duvar hücreleri glikoproteinlere ek olarak selüloz, hemiselüloz ve pektin oluşur, ve lignin eksikliği, ikincil hücre duvarı mevcut bir bileşeni2. Selüloz, β-1,4 bağları ile birbirine bağlı bir glikoz polimer, hücre duvarlarının ana bileşenidir. Hücre büyümesi sırasında yaşanan yüksek çekme kuvvetlerine dalabilen fibriller yapılar halinde organize edilir3. Çekme kuvvetlerine dayanmanın yanı sıra, tercihli yönde mekanik takviye selüloz mikrofibril net yönünü dik bir eksen boyunca turgor tahrikli genişleme ile sonuçlanır. Selüloz mikrofibrillerin organizasyonu kortikal mikrotübül sitoiskeletinden etkilenir, çünkü plazma zarında bulunan selüloz sentezleyici komplekslerin yön hareketini yönlendirirler4. Bu nedenle, bir floresan molekül ile erimiş bir mikrotübül ilişkili protein veya tubulin kullanarak kortikal mikrotübül organizasyonu izleme bitki hücrelerinde selüloz örten desenlerin gözlem için bir proxy olarak hizmet vermektedir.
Kortikal mikrotübül sitoiskeletinin desenlemi hücre ve doku morfolojisi kaynaklı mekanik kuvvetlerin kontrolü altındadır. Kortikal mikrotübül organizasyonu SAM’in tepesinde bulunan hücrelerde zaman içinde herhangi bir tercihli organizasyona sahip değildir, oysa SAM ve gelişmekte olan organ arasındaki çevre ve sınırdaki hücreler kortikalmikrotübüllerin kararlı, son derece organize suprasellüler dizilimine sahiptir 5 . Hücrelerin mekanik durumunu fiziksel olarak rahatsız etmek için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir. Ozmotik durum değişiklikleri, hücre duvarının sertliğini etkileyen farmakolojik ve enzimatik bileşikler ile tedavi hücre tarafından deneyimli çekme kuvvetlerinde sonraki değişikliklere neden olabilir6,7. Dokuların yaşadığı kompresif kuvvetlerde kademeli artışa olanak sağlayan mekanizmaların kullanımı başka bir alternatif8. Santrifüj kuvvetlerinin uygulanması da hücreleri ile herhangi bir fiziksel temas olmadan mekanik kuvvetleri etkilemek için gösterilmiştir9. Ancak, bir grup hücrede yön kuvvetlerini değiştirmenin en yaygın olarak kullanılan araçları, tüm epidermal hücrelerin gerilim altında olduğu ve hücrelerin fiziksel ablasyonunun yerel olarak turgor basıncını ortadan kaldıracağı ve hücreden hücreye yapışmasını bozacağı ve komşu hücrelerin yaşadığı çekme kuvvetlerini değiştireceği gerçeğinden yararlanır. Bu ya yüksek güçlü darbeli ultraviyole lazer hedefleyerek ya da ince bir iğne ile gerçekleştirilir.
Burada, SAM’de mekanik pertürbasyon için kortikal mikrotübül davranışının görüntülenmesi ve değerlendirilmesi süreci hakkında ayrıntılı bilgi ve regülasyon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mekanik sinyal transdüksiyon olaylarının değerlendirilmesi, mekano-algılama ve transdüksiyon yollarında yer alan moleküler düzenleyicileri belirlemek için çok önemlidir. Burada açıklanan protokol Arabidopsis SAM böyle bir süreç için bir okuma olarak kortikal mikrotübül yanıtı kullanarak bu tür olayların nicel bir görünüm sağlar. Burada açıklanan prosedür rutin çeşitli doku tipleri çeşitli çalışmalarda kullanılır16,17</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hiçbiri.
Materials
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| micropore tape | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
| myo-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benzyladenine | Sigma | B3408 | |
| nicotinic acid | Sigma | N4126 | |
| plastic hinged box | Electron microscopy sciences | 64312 | |
| PPM (Plant Preservative Mixture) | Plant Cell Technology | PPM | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 |
References
- Cosgrove, D. J. Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly. Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).
- McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. The cell biology of cellulose synthesis. Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).
- Burgert, I. Exploring the micromechanical design of plant cell walls. American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).
- Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules. Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).
- Barbier de Reuille, P., et al. MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D. Elife. 4, 05864 (2015).
- Kierzkowski, D., et al. Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem. Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).
- Heisler, M. G., et al. Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport. PLoS Biology. 8 (10), e1000516 (2010).
- Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline. Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).
- Nakayama, N., et al. Mechanical regulation of auxin-mediated growth. Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).
- Marc, J., et al. A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells. Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).
- Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX. Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks. BMC Biology. 17 (1), 38 (2019).
- Boudaoud, A., et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).
- Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), (2019).
- Hervieux, N., et al. A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis. Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).
- Sampathkumar, A., et al. Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells. Elife. 3, e01967 (2014).
- Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), dev179036 (2019).
- Uyttewaal, M., et al. Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis. Cell. 149 (2), 439-451 (2012).
- Hamant, O., et al. Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis. Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).
