הדמיה חיה של ציטוסקלטון Microtubule ומניפולציה מיקרומכנית של Arabidopsis לירות מריסטם Apical
Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול להדמיית תאים חיים של השלד המיקרו-טבובול הקליפתי ב”ירי” ומנטר את תגובתו לשינויים בכוחות הפיזיים.
Abstract
הבנת רגולציה ברמת התא והרקמות של צמיחה ומורחוגנזה כבר בחזית המחקר הביולוגי במשך עשורים רבים. ההתקדמות בטכנולוגיות מולקולריות והדמיה אפשרה לנו לקבל תובנות כיצד אותות ביוכימיים משפיעים על אירועים מורפוגנטיים. עם זאת, זה יותר ויותר ברור כי מלבד אותות ביוכימיים, רמזים מכניים גם להשפיע על מספר היבטים של צמיחת תאים ורקמות. Arabidopsis לירות meristem apical (SAM) הוא מבנה בצורת כיפה אחראי על הדור של כל האיברים מעל פני הקרקע. הארגון של השלד ציטוסק המיקרוטובולה קליפתית כי מתווכת תצהיר תאית אפופלסטית בתאי הצמח הוא ייחודי מרחבית. הדמיה והערכה כמותית של דפוסים של מיקרוטובוליות קליפתיות נחוצים להבנת האופי הביופיזי של תאים ב SAM, כמו תאית הוא המרכיב הנוקשה ביותר של קיר התא צמח. הצורה הסטריאוטיפית של ארגון מיקרוטובולה קליפתית היא גם תוצאה של כוחות פיזיים רחבים רקמות הקיימים ב-SAM. סטייה של כוחות פיזיים אלה וניטור עוקבות של ארגון מיקרוטובולה קליפתית מאפשר זיהוי של חלבונים מועמד מעורב בתיווך תפיסה מכנו ותזוזה. כאן אנו מתארים פרוטוקול המסייע לחקור תהליכים כאלה.
Introduction
תאי הצמח מוקפים מטריצה חוץ תאית של פוליסכרידים ו גליקופרוטינים הדומה מכנית לחומר מרוכב מחוזק סיבים המסוגל לשנות באופן דינמי את תכונותיו המכניות1. צמיחה בתאי הצמח מונעת על ידי ספיגת מים לתוך התא, מה שופך הצטברות במקביל של כוחות מתיחה על קיר התא. בתגובה לכוחות כאלה, שינויים במצב הפיזי של קיר התא מאפשרים התרחבות תאים. תאים עם קירות ראשיים מסוגלים לעבור צמיחה מהירה לעומת קיר תא משני המכיל תאים בעיקר בשל הבדלים בהרכב הכימי של הפוליסכרידים בפנים. תאי קיר ראשיים מורכבים תאית, hemicellulose, פקטין, בנוסף גליקופרוטינים, וחסר ליגנין, רכיב כי הוא קיים בקיר התא המשני2. תאית, פולימר גלוקוז מקושר באמצעות β-1,4 אג”ח, הוא המרכיב העיקרי של קירות התא. הוא מאורגן לתוך מבנים fibrillar המסוגלים לעמוד כוחות מתיחה גבוהה חוו במהלך צמיחת התא3. בנוסף לכוחות מתיחה עומדים, חיזוק מכני לאורך כיוון מועדף תוצאתו התרחבות מונעת טורגור לאורך ציר ניצב לכיוון נטו של מיקרופיבריל תאית. הארגון של מיקרופיבריל תאית מושפע microtubule קליפתי cytoskeleton, כפי שהם מנחים את התנועה הכיוונית של תאית סינתזה מורכבים הממוקמים קרום פלזמה4. לכן, ניטור ארגון microtubule קליפתי באמצעות חלבון או צינור הקשורים microtubule התמזגו עם מולקולת פלורסנט משמש פרוקסי לתצפית על דפוסים של תאית בתאי הצמח.
התבניות של השלד ציטוסק microtubule קליפתי נמצא תחת שליטה של מורפולוגיה תא ורקמות נגזר כוחות מכניים. ארגון microtubule קליפתי אין כל ארגון מועדף לאורך זמן בתאים הממוקמים בשיאו של SAM, בעוד תאים בפריפריה ואת הגבול בין SAM האיבר המתעוררים יש יציב, מערך סופר-גולגולתי מאורגן מאוד של מיקרוטובולותקליפתיות 5. מספר גישות פותחו כדי לפגוע פיזית במצב המכני של התאים. שינויים במצב osmotic, כמו גם טיפול עם תרכובות פרמקולוגיות אנזימטיות המשפיעות על הנוקשות של קיר התא יכול לגרום לשינויים הבאים בכוחות מתיחהשחוו תא 6,7. השימוש במתקן המאפשר עלייה הדרגתית בכוחות הלחץ שחוו רקמות הוא חלופה נוספת8. יישום של כוחות צנטריפוגליים גם הופק להשפיע על הכוחות המכניים ללא כל מגע פיזי עם התאים9. עם זאת, האמצעים הנפוצים ביותר של שינוי כוחות כיווניים בקבוצת תאים לנצל את העובדה כי כל התאים האפידרמיס נמצאים תחת מתח אבלציה פיזית של תאים יבטל את לחץ turgor באופן מקומי, כמו גם לשבש הדבקה מתא לתא, ובכך לשנות את כוחות מתיחה שחוו התאים השכנים. זה מבוצע או על ידי מיקוד לייזר אולטרה סגול פעמו רב עוצמה או באמצעות מחט בסדר.
כאן אנו מפרטים על תהליך ההדמיה וההערכה של התנהגות מיקרוטובולה קליפתית עבור סטייה מכנית ב SAM.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההערכה של אירועי תמרת אותות מכניים היא קריטית לזיהוי רגולטורים מולקולריים המעורבים במסלולי התפיסה והמתמר המכנו. הפרוטוקול המתואר כאן מספק תצוגה כמותית של אירועים כאלה באמצעות תגובת microtubule קליפתי כקריאה עבור תהליך כזה ב- Arabidopsis SAMs. ההליך המתואר כאן משמש באופן שגרתי במספר מחקרים בסוגי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ללא.
Materials
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| micropore tape | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
| myo-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benzyladenine | Sigma | B3408 | |
| nicotinic acid | Sigma | N4126 | |
| plastic hinged box | Electron microscopy sciences | 64312 | |
| PPM (Plant Preservative Mixture) | Plant Cell Technology | PPM | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 |
References
- Cosgrove, D. J. Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly. Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).
- McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. The cell biology of cellulose synthesis. Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).
- Burgert, I. Exploring the micromechanical design of plant cell walls. American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).
- Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules. Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).
- Barbier de Reuille, P., et al. MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D. Elife. 4, 05864 (2015).
- Kierzkowski, D., et al. Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem. Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).
- Heisler, M. G., et al. Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport. PLoS Biology. 8 (10), e1000516 (2010).
- Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline. Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).
- Nakayama, N., et al. Mechanical regulation of auxin-mediated growth. Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).
- Marc, J., et al. A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells. Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).
- Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX. Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks. BMC Biology. 17 (1), 38 (2019).
- Boudaoud, A., et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).
- Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), (2019).
- Hervieux, N., et al. A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis. Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).
- Sampathkumar, A., et al. Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells. Elife. 3, e01967 (2014).
- Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), dev179036 (2019).
- Uyttewaal, M., et al. Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis. Cell. 149 (2), 439-451 (2012).
- Hamant, O., et al. Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis. Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).
