Live Cell Imaging av Microtubule Cytoskeleton og Mikromekanisk manipulering av Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Summary

Her beskriver vi en protokoll for levende celleavbildning av det kortikale mikrotubulicycyskeletonen ved skyteapokaell meristem og overvåking av responsen på endringer i fysiske krefter.

Abstract

Forstå celle og vev nivå regulering av vekst og morfogenese har vært i forkant av biologisk forskning i mange tiår. Fremskritt innen molekylære og bildeteknologier gjorde det mulig for oss å få innsikt i hvordan biokjemiske signaler påvirker morfogenetiske hendelser. Det er imidlertid stadig tydeligere at bortsett fra biokjemiske signaler, påvirker mekaniske signaler også flere aspekter av celle- og vevsvekst. Arabidopsis skyte apical meristem (SAM) er en kuppelformet struktur ansvarlig for generering av alle overjordiske organer. Organiseringen av det kortikale mikrotubulicytskeletonet som formidler apoplastisk cellulosedeponering i planteceller er romlig distinkt. Visualisering og kvantitativ vurdering av mønstre av kortikale mikrotubuli er nødvendig for å forstå cellenes biofysiske natur ved SAM, da cellulose er den kvelende komponenten i plantecelleveggen. Den stereotypiske formen for kortikale mikrotubuli organisasjon er også en konsekvens av vev-wide fysiske krefter som finnes på SAM. Perturbasjon av disse fysiske kreftene og påfølgende overvåking av kortikale mikrotubuli organisasjon gjør det mulig for identifisering av kandidatproteiner involvert i å megle mekano-persepsjon og transduksjon. Her beskriver vi en protokoll som bidrar til å undersøke slike prosesser.

Introduction

Planteceller er omgitt av en ekstracellulær matrise av polysakkarider og glykoproteiner som mekanisk ligner et fiberforsterket komposittmateriale som er i stand til å dynamisk endre sine mekaniske^{egenskaper 1}. Vekst i planteceller er drevet av opptaket av vann inn i cellen, noe som resulterer i en samtidig oppbygging av strekkkrefter på celleveggen. Som svar på slike krefter tillater endringer i celleveggens fysiske tilstand celleutvidelse. Celler med primærvegger er i stand til å gjennomgå rask vekst sammenlignet med sekundærcellevegg som inneholder celler, hovedsakelig på grunn av forskjeller i polysakkarides kjemiske sammensetning innenfor. Primære veggceller består av cellulose, hemicellulose og pektin i tillegg til glykoproteiner, og mangler lignin, en komponent som er tilstede i den sekundære celleveggen². Cellulose, en glukosepolymer knyttet β-1,4 bind, er den viktigste komponenten i celleveggene. Det er organisert i fibrillar strukturer som er i stand til å motstå høye strekkkrefter opplevd under cellevekst³. I tillegg til å motstå strekkfasthet, resulterer mekanisk forsterkning langs en fortrinnsrett retning i turgordrevet ekspansjon langs en akse vinkelrett på nettorienteringen til cellulosemikrofibril. Organiseringen av cellulosemikrofibrillene påvirkes av det kortikale mikrotubulicycytskeleton, da de styrer retningsbevegelsen til cellulosesyntetiserende komplekser som ligger ved plasmamembranen⁴. Derfor, overvåking kortikale mikrotubuli organisasjon ved hjelp av en mikrotubbul-assosiert protein eller tubulin smeltet med et fluorescerende molekyl fungerer som en proxy for observasjon av overlying mønstre av cellulose i planteceller.

Mønsteret av kortikale mikrotubuli cytoskeleton er under kontroll av celle- og vevmorfologi avledet mekaniske krefter. Kortikal mikrotubuli organisasjon har ingen fortrinnsrett organisasjon over tid i celler som ligger på toppen av SAM, mens celler i periferien og grensen mellom SAM og det nye organet har en stabil, svært organisert supracellular utvalg av kortikale mikrotubuli⁵. Flere tilnærminger er utviklet for å fysisk perturb den mekaniske statusen til cellene. Endringer i osmotisk status, samt behandling med farmakologiske og enzymatiske forbindelser som påvirker stivheten i celleveggen, kan føre til påfølgende endringer i strekkkreftene som oppleves av cellen^6,7. Bruken av innretninger som tillater gradvis økning i kompresjonskrefter opplevd av vev er et annet alternativ⁸. Bruk av sentrifugalkrefter har også vist seg å påvirke de mekaniske kreftene uten fysisk kontakt med cellene⁹. Imidlertid utnytter de mest brukte måtene å endre retningskrefter i en gruppe celler seg av det faktum at alle epidermale celler er under spenning og fysisk ablasjon av celler, eliminere turgortrykk lokalt, samt forstyrre celle-til-celle-vedheft, og dermed endre strekkkreftene oppleves av de nærliggende cellene. Dette utføres enten ved å målrette en kraftig pulserende ultrafiolett laser eller ved hjelp av en fin nål.

Her utdyper vi prosessen med avbildning og vurdering av kortikal mikrotubuli atferd for mekanisk perturbasjon ved SAM.

Protocol

1. Plantevekst Så Arabidopsis frø uttrykker mikrotubuli bindende domene smeltet sammen med grønt fluorescerende protein (MBD-GFP)10 på jord og holde i lang dag (16 timer dag / 8 h natt), 20 ° C / 6 ° C forhold i 1 uke for spiring. Etter spiring, overføre frøplanter til nye potter med tilstrekkelig vekst plass for å tillate robust vegetativ vekst. Oppbevar planter på kort dag (8 timer dag /16 timer natt), 20 °C/16 °C i 3-5 uker. Overfør planter ti…

Representative Results

Figur 1 viser typiske projeksjonsbilder hentet fra MBD-GFP-linjer med celler i midten av kuppelen som inneholder uorganiserte kortikale mikrotubuli, og celler i periferien har en omkretsfordeling (figur 1A,B), mens grensedomenecellene inneholder kortikale mikrotubuli justert parallelt med cellens lange akse. Disse observasjonene viser forskjeller i romlig fordeling av kortikale mikrotubuli i de forskjellige domen…

Discussion

Vurderingen av mekaniske signaltransduksjonshendelser er avgjørende for å identifisere molekylære regulatorer som er involvert i mekano-persepsjons- og transduksjonsbanene. Protokollen som er beskrevet her gir et kvantitativt syn på slike hendelser ved å bruke den kortikale mikrotubuliresponsen som en avlesning for en slik prosess i Arabidopsis SAMs. Prosedyren beskrevet her brukes rutinemessig i flere studier i ulike vevstyper^16,17,<sup …

Materials

FibrilTool			Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014
FIJI			Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012
glycine	Merck	1.04201.1000
Leica SP8 confocal microscope	Leica	DM6000 CS
MAP4-GFP			Marc, J. et al., Plant Cell 1998
micropore tape	Leukopor	02482-00
MorphographX			Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019
myo-inositol	Sigma	I5125
N6-benzyladenine	Sigma	B3408
nicotinic acid	Sigma	N4126
plastic hinged box	Electron microscopy sciences	64312
PPM (Plant Preservative Mixture)	Plant Cell Technology	PPM
Propidium iodide	Sigma	P4864
pyridoxine hydrochloride	Sigma	P9755
SURFCUT			Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019
thiamine hydrochloride	Sigma	T4625