Conjugués de BODIPY conventionnels pour la microscopie à super-résolution à cellules vives et le suivi à molécule unique
Summary
Les conjugués conventionnels de BODIPY peuvent être employés pour la microscopie de localisation à cellule unique vivante (SMLM) par l’exploitation de leurs dimers terrestres de formation transitoire et à miettes rouges. Nous présentons un protocole SMLM optimisé pour suivre et résoudre les lipides neutres subcellulaires et les acides gras dans les cellules vivantes de mammifères et de levure à l’échelle de longueur nanoscopique.
Abstract
Les techniques de microscopie de localisation à molécule unique (SMLM) surmontent la limite de diffraction optique de la microscopie conventionnelle de fluorescence et peuvent résoudre les structures intracellulaires et la dynamique des biomolécules avec une précision de 20 nm. Une condition préalable pour SMLM sont les fluorophores qui passent d’un état sombre à un état fluorescent afin d’éviter le chevauchement spatio-temporel de leurs fonctions de propagation de points dans chacun des milliers de cadres d’acquisition de données. Les BODIPY sont des colorants bien établis avec de nombreux conjugués utilisés dans la microscopie conventionnelle. La formation transitoire de dimers d’état au sol BODIPY (DII)à l’origine d’une seule molécule brillante permet une microscopie de localisation à une seule molécule (SMLM). Ici, nous présentons un protocole simple mais polyvalent pour SMLM avec des conjugués conventionnels BODIPY dans la levure vivante et les cellules de mammifères. Cette procédure peut être utilisée pour acquérir des images super-résolution et pour suivre les états seuls de BODIPY-DII pour extraire des informations spatio-temporelles des conjugués de BODIPY. Nous appliquons cette procédure pour résoudre les gouttelettes lipidiques (LD), les acides gras et les lysosomes dans la levure vivante et les cellules de mammifères à l’échelle de longueur nanoscopique. En outre, nous démontrons la capacité d’imagerie multi-couleurs avec des colorants BODIPY lorsqu’ils sont utilisés en conjonction avec d’autres sondes fluorescentes. Nos résultats représentatifs montrent la répartition spatiale différentielle et la mobilité des acides gras BODIPY et des lipides neutres dans la levure dans des conditions nourries et jeûnées. Ce protocole optimisé pour SMLM peut être utilisé avec des centaines de conjugués BODIPY disponibles dans le commerce et est une ressource utile pour étudier les processus biologiques à l’échelle nanométrique bien au-delà des applications de ce travail.
Introduction
Les techniques de microscopie de localisation à molécule unique (SMLM) telles que la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) et la microscopie localisée activée par photo (PALM) sont apparues comme des méthodes pour générer des images super-résolution avec des informations au-delà de la limite de diffraction optique d’Abbe1,2 et pour suivre la dynamique des biomoléculesuniques 3,4. L’une des exigences pour les sondes compatibles avec SMLM est la capacité de contrôler le nombre de fluorophores actifs à tout moment pour éviter le chevauchement spatial de leurs fonctions de propagation ponctuelle (PSF). Dans chacun des milliers d’images d’acquisition de données, l’emplacement de chaque fluorophores fluorescent est ensuite déterminé avec une précision de 20 nm en adaptant sa fonction de répartition ponctuelle correspondante. Traditionnellement, le clignotement on-off des fluorophores a été contrôlé par photoswitching stochastique1,2,5 ou chimiquement induite clignement intrinsèque6. D’autres approches incluent l’activation induite des fluorogènes sur la liaison transitoire à une protéine fluorogène-activante7,8 et la liaison programmable-unbinding des oligomers d’ADN étiquetés dans la fluorescence interne totale de réflexion (TIRF) ou l’excitation de feuille de lumière9. Récemment, nous avons rapporté une stratégie d’étiquetage nouvelle et polyvalente pour SMLM10 dans laquelle précédemment rapporté rouge décalé dimeric (DII) états de bore conventionnel di-pyromethane (BODIPY) conjugués11,12,13 sont transitoirement formant et deviennent spécifiquement excités et détectés avec des longueurs d’onde rouge-décalées.
BODIPYs sont des colorants largement utilisés avec des centaines de variantes qui étiquetent spécifiquement les compartiments sous-cellulaires et les biomolécules14,15,16. En raison de leur facilité d’utilisation et de leur applicabilité dans les cellules vivantes, les variantes BODIPY sont disponibles dans le commerce pour la microscopie à fluorescence conventionnelle. Ici, nous décrivons un protocole détaillé et optimisé sur la façon dont les centaines de conjugués BODIPY disponibles dans le commerce peuvent être utilisés pour les CELLULES vivantes SMLM. En accordant la concentration des monomers BODIPY et en optimisant les pouvoirs laser d’excitation, les paramètres d’imagerie et d’analyse de données, les images super-résolutions de haute qualité et les données de suivi d’une seule molécule sont obtenues dans les cellules vivantes. Lorsqu’ils sont utilisés à faible concentration (25-100 nM), les conjugués BODIPY peuvent être utilisés simultanément pour SMLM dans le canal red-shifted et pour la microscopie de fluorescence conventionnelle corrélative dans le canal d’émission classique. Les données sur les molécules uniques obtenues peuvent être analysées pour quantifier l’organisation spatiale des structures immobiles et pour extraire les états diffusifs des molécules dans les cellules vivantes17. La disponibilité des sondes BODIPY sous forme verte et rouge permet une imagerie multicolore lorsqu’elle est utilisée dans la bonne combinaison avec d’autres fluorophores compatibles.
Dans ce rapport, nous fournissons un protocole optimisé pour l’acquisition et l’analyse des données SMLM à cellules vivantes à l’aide de BODIPY-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 rouge et lysotracker-vert en plusieurs couleurs. Nous résolvons les acides gras et les lipides neutres dans les cellules vivantes de levure et de mammifères avec la résolution de nm de 30 nm. Nous démontrons en outre que les cellules de levure régulent la distribution spatiale des acides gras ajoutés à l’extérieur en fonction de leur état métabolique. Nous constatons que les acides gras BODIPY ajoutés (FA) se localisent au réticulum endoplasmique (ER) et aux gouttelettes lipidiques (LD) dans des conditions alimentées tandis que les BODIPY-FAs forment des grappes non LD dans la membrane plasmatique au jeûne. Nous étendons davantage l’application de cette technique aux lysosomes et LD d’image dans les cellules vivantes de mammifères. Notre protocole optimisé pour SMLM utilisant les conjugués conventionnels de BODIPY peut être une ressource utile pour étudier des processus biologiques à l’échelle nanométrique avec la myriade de conjugués BODIPY disponibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous avons démontré comment les conjugués conventionnels DE BODIPY peuvent être utilisés pour obtenir des images SMLM avec un ordre d’amélioration de grandeur dans la résolution spatiale. Cette méthode est basée sur l’exploitation précédemment rapportée, rouge-décalé DII états des colorants conventionnels BODIPY, qui se forment transitoirement par des rencontres bi-moléculaires. Ces états peuvent être spécifiquement excités et détectés avec des longueurs d’onde re…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health sous le numéro d’attribution R21GM127965.
Materials
| BODIPY C12 | ThermoFisher | D3822 | Green fatty acid analog |
| BODIPY C12 Red | ThermoFisher | D3835 | Red fatty acid analog |
| BODIPY(493/503) | ThermoFisher | D3922 | Neutral lipid marker |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2010 | Cell immobilization on glass surface |
| Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base | US Biological | D9515 | Amino acids for SCD |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G7021 | Carbon source for SCD |
| Eight Well | Cellvis | C8-1.58-N | Chambered Coverglasses |
| Eight Well, Lb-Tek II | Sigma-Aldrich | Chambered Coverglasses | |
| ET525/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET595/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET610/75 | Chroma | Bandpass filter | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | Serum |
| FF652 | Semrock | Beam splitter | |
| FF731/137 | Semrock | Bandpass filter | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | Cell culture medium |
| Hal4000 | Zhuang Lab, Harvard University | Data acquisition software | |
| Ixon89Ultra DU-897U | Andor | EMCCD camera for photon detection | |
| Laser 405, 488, 561, 640 nm | CW-OBIS | Lasers for excitation | |
| Insight3 | Zhuang Lab, Harvard University | Single molecule localization software | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Amino acid required for cell culture |
| live-cell imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | Imaging buffer |
| Lysotracker Green | ThermoFisher | L7526 | Bodipy based lysosome marker |
| Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) | Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota) | ||
| Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A | Nikon | Oil immersion objective | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | Antibiotics |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Supplement for cell culture |
| T562lpxr | Chroma | Beam splitter | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Dissociation of adherent cell |
| W303 MATa strain | Horizon-Dharmacon | YSC1058 | Parental yeast strain |
| Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y1250 | Nitrogen base without amino-acids |
| zt405/488/561/640rdc | Chroma | Quadband dichroic mirror | |
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