Summary
ここに提示されたラットのうつ病のような行動とアンヘドニックな行動を研究するためのプロトコルです。これは、2つの確立された行動方法、スクロースの好みと新規性誘発性低phphagiaテストを組み合わせて、自動食品および液体摂取量監視システムを組み合わせて、代理パラメータを使用してげっ歯類の行動を間接的に調査します。
Abstract
うつ病の罹患率と罹患率は世界的に増加しており、約3億2,200万人の個人に影響を及ぼし、動物モデルにおける行動研究の必要性を強調している。このプロトコルでは、ラットにおけるうつ病様およびアンヘドニック挙動を研究するために、確立されたショ糖嗜好および新規発性誘発性低phphagia検査を、自動化された食物および液体摂取モニタリングシステムと組み合わせる。試験の前に、ショ糖好みのパラダイムにおいて、オスラットは、水道水に加えてスクロース溶液を消費するために少なくとも2日間訓練される。試験中、ラットは再び水とスクロース溶液に曝されます。消費は自動化システムによって毎秒登録されます。総水摂取量に対するスクロースの比率(ショ糖選好率)は、アンヘドニアの代理パラメータである。新皮性低血圧検査では、雄のラットは、口当たりの良いスナックにさらされるトレーニング期間を受ける。トレーニング中、げっ歯類は安定したベースラインスナック摂取量を示します。テスト日には、動物は自宅のケージから、既知の味わい深いスナックにアクセスできる新しい未知の環境を表す新鮮で空のケージに移されます。自動システムは、総摂取量とその基礎となる微細構造(例えば、スナックに近づくまでの待ち時間)を記録し、アンヘドニックおよび不安な行動に関する洞察を提供します。これらのパラダイムと自動測定システムの組み合わせにより、測定誤差を低減することで、より詳細な情報と精度を提供します。しかし、テストは代理パラメータを使用し、うつ病とアンヘドニアを間接的に描写するだけです。
Introduction
世界の人口の平均4.4%がうつ病の影響を受けています。これらの人は全世界で3億2,200万人を占め、10年前に比べて18%増加しました。世界保健機関(WHO)の推計によると、うつ病は2020年の障害調整寿命年のランキングで2位になります。情動障害の増加に対処し、新しい介入戦略を確立するために、この行動をさらに研究する必要があります。ヒトの検査の前および他に、動物実験が必要である。
うつ病行動の構成要素(すなわち、強制泳ぎ試験、尾懸濁試験、ショ糖好性試験、および新規発性誘発性低血圧)3,4,4の成分を研究するためにいくつかのモデルが確立されている。スクロース好み検査(SPT)および新規性誘発性低血圧(NIH)は、動物のうつ病様の行動を検出することができる。これらのテスト自体はげっ歯類のうつ病の状態を誘発しませんが、行動の急激な変化を描いています。SPTとNIHの両方がアンヘドニアとして知られているうつ病の特徴的な特徴を評価し、これは以下の関心の喪失である:やりがいのある活動、かつて個人5によって楽しまれた活動、および報酬6に対処する複雑な現象の1つの側面。両方のテストは、味わい深い食べ物の形でやりがいのある刺激に対する反応を研究します。消費の範囲は、アンヘドニア7、8,、9の代理パラメータとして機能します。9
アンヘドニアを調査するテストの値は、物質の重量の正確な測定から生じる消費の正確な決定に強く依存しています。従来、この測定は試験の前後に1回手動で行われる。ただし、これはいくつかの理由で誤った測定を行う傾向があります。まず、げっ歯類は食べ物を買いだめする傾向があり、すぐに食べ物を消費せずに食べ物を取り除き、安全な場所に隠すことを意味します。したがって、この食品の損失は、総消費量の計算に含まれてもよい。第二に、ラットは食物と水をこぼし、それぞれの消費なしに体重減少をもたらす。第三に、ボトルをケージから挿入および取り外すことによって、ボトルの取り扱いにより、意図しない液体の損失が生じる。
これらのエラー源を減らすアプローチでは、アンヘドニア(SPT33、4、NIH4 9)を評価する2つの一般的な試験と、自動食品および液体摂取量監視システムを使用した食品および水分摂取量の測定を組み合わせました。この手順は、口当たりの良い物質の消費の正確な調査を可能にするだけでなく、うつ病のような行動の特徴としてラットの喜びの経験に関する情報を提供します。手動測定に関連する上記のエラーは、後で詳しく説明する別のアプローチを使用して削減されます。
微細構造に関する情報を提供するために、このプロトコル10 で使用される自動摂取監視システムは、食品(±0.01g)を毎秒計量する。したがって、安定した体重は「食べない」と記録され、不安定な体重は「食べる」と表現される。「バウト」は、イベントの前後の安定した重量の変化として定義されます。食事は1つ以上の発作から成り、ラットの最小サイズは0.01gと定義された。食事は、ラットの別の食事から15分(標準化値)で分離される。したがって、食物摂取量は、15分以内に発作が起こり、体重変化が0.01g以上である場合の1食であると考えられる。このプロトコルで評価される食事パラメータには、食事の期間、食事に費やされた時間、吹き出物のサイズ、試合時間、吹き出物に費やされた時間、最初の試合までの待ち時間、およびバウトの数が含まれます。
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Protocol
動物のケアと実験手順は、特定の制度倫理ガイドラインに従い、動物研究のための国家当局によって承認されました。
1. 自動監視システムの運用
注: 自動監視システムを操作する場合、アクションの直前にソフトウェアに含まれるコメントボックスに、すべてのアクションを文書化することが重要です。説明はコメント ボックスに入力し 、Saveキーを押すと特定のタイム ポイントで保存されます。タイムポイントは、システムが継続的に記録し、対象期間を分析のために指定する必要があるため、データを分析する際に重要です。
- 自動監視システムの設置、使用、保守
注:このプロトコルは、体重250〜300g(約10週齢)の成人雄のスプレイグ・ドーレーラットを使用しています。順応期間中にラットを集団で収容することをお勧めします。環境条件は、6:00 A.M.のライトを点灯する12時間/12時間の暗/光サイクル、湿度45%~65%、温度21~23°C、水および標準げっ歯類食への アドリビタム アクセスのパラメータで制御する必要があります。毎日の取り扱いにより、動物は調査官に慣れることができました。- すべての動物が個々のケージを持っているようにラットを分離します。すべてのラットがプロトコル中に分離されたままであることを確認します。
- ハウジングケージに通常の寝具を1~2cm厚い層で満たします。この(減少した)量は、マイクロバランスとホッパーのこぼれによる汚染の可能性を減少させ、それによって測定誤差を低減する。プラスチック管(直径8cmのプラスチック製排水管の長さ20cm)を加え、紙のティッシュを省略しながら、木材を濃縮して測定誤差を減らします。
- ケージの前面にあるカスタムメイドの穴にマイクロバランスを備えた2つの閉じたケージマウントを取り付けることで、自動固体および液体食品の取り込み測定のためにケージを準備します。ケージマウントに空のホッパーを2つ、チャウ用とボトル用のホッパーを2つ置きます。
メモ:マイクロバランスは、コンピュータに接続された記録システムにケーブルで接続され、それぞれのソフトウェアがコンピュータにインストールされています。 - 記録を開始するには、"Monitor"を開いて [スタート] ボタンを押し、データを保存する場所を選択します。
- 自動摂取監視システムのキャリブレーション(プレス「キャリブレーション」機能)を使用して、ホッパーを取り外し、バランスを取ってケージマウントに2つの異なるゲージ重量を配置することで、すべてのバランスをキャリブレーションします。定期的な間隔で行います (毎週推奨)。
- 1ホッパーをチャウ(約100g)で完全に満たし、小さすぎるチャウピースや崩れを取り除きます。ボトル(約100mL)に水を入れ、もう一方のホッパーに入れます。
- 食品および水の位置を文書化する(例えば、バランス1:食品動物1、バランス2:水動物1)。
- ネズミをケージに入れ、ケージマウントのすべてのゲートを開けて、 アドリビタムを食べたり飲んだりできるようにします。
注意:正確な測定のためには、こぼれからブラシで優しく清掃し、食品容器から小さな食品パン粉を取り除くことによって、毎日バランスとホッパーを維持する必要があります。これにより、誤った測定が大幅に減少します。毎日のメンテナンス中にすべてのゲートを閉じます。
- 実験後のデータへのアクセス
- 分析が必要な期間の開始タイムポイントと終了タイムポイント (トレーニング、テストなど) をコメントボックスで検索します。
- ソフトウェアの [データの表示] をクリックして、データ ビューアを開きます。
- [開始時刻] と [終了時刻] の下のボックスにタイム ポイントを挿入します。情報を記録した残高を示す左上隅の四角を押します。
- 「PSC の合計」をクリックして、マイクロストラクチャデータにアクセスします。[PSCテーブルのエクスポート] ボタンを押して、データをエクスポートします。
注:自動監視を用いて個々の動物の微細構造(ストレスを受けていない場合とストレスを感じる)を比較するために、左上隅の適切な正方形を押すことで個々の動物を「データビューア」 で選択することができます。 PSC の合計は、 選択した動物の微細構造のみを示します。統計分析はシステムでは実行できません。データは、スプレッドシートプログラム/分析ソフトウェアに抽出する必要があります。
2. スクロース選好試験の実施
- トレーニング期間の実施
注:テストの前に、動物はゲートを通ってホッパーの液体のための2つのボトルの入手可能性に慣れなければなりませんが、食べ物はケージの上から提供されるべきです(セットアップは 図1に示されています)。このトレーニング期間は、少なくとも2日間続く必要があります。動物が収容されている部屋のホームケージで行われます。- すべてのゲートを閉じます。マイクロバランスから水筒と食品容器を取り除きます。
- ケージの上に計量済みの食品(50g)を置き、毎日の食品消費量を評価するために定期的なバランスを使用して、毎日その重量を文書化します。必要に応じて補充します。
- 透明な水でボトルを清掃し、約100mLの水で補充してください。ホッパーに戻します。
- 2番目のきれいなボトルに、作りたての1%スクロース溶液100mLを充填します。ホッパーの上に置きます。
注:ボトルを注意深くマークし、その位置を文書化します(例えば、バランス1:水動物1、バランス2:スクロース溶液動物1)。 - すべてのゲートを開きます。監視システムでのトレーニングの開始を文書化します。ゲートを24時間開いたままにして、両方のボトルへの アドリビタム アクセスを行います。24時間後、ゲートを閉じてトレーニングの終了を記録します。24時間間隔のデータは、自動監視システムを使用して、 "開始時刻" と "終了時刻" を挿入することで評価できます。手順は、1時間のテスト間隔が評価されるときと同じです。
- ボトルは24時間ごとに清掃して補充してください。新鮮な1%スクロース溶液を毎日準備します。水とスクロース溶液ボトルの位置を毎日切り替えて、習慣効果を避けてください。
注:優先比が1〜1に達するまで、すべての動物で少なくとも48時間の訓練を行います。ショ糖の好率は、トレーニング後に「データビューア」を使用して直接評価されます。これは、全体的な摂取量(水とスクロース摂取量)に対するスクロース摂取量の比率として計算されます。 - 試験の24時間前に、ラットが標準的なチャウと水のみにアクセスできるように、スクロース溶液でボトルを取り除きます。
- 水道水で満たされた新鮮なボトル1本と1%のスクロース溶液で満たされたものを、両方とも〜100 mLで準備します。
- テストを行う前に、すべてのゲートを閉じてください。
- ホッパーから水道水で満たされたボトルを取り出し、2つの新鮮なボトル(1本は水道水で満たし、もう1本は1%のスクロース溶液で満たされたもの)をホッパーに置きます。
- すべてのゲートを開き、監視システムでテストの開始を文書化します。ゲートは60分間開いたままにしておきます。60分後にゲートを閉じ、テストの終了を記録します。
- データを評価します(例えば、スクロース/総流体摂取量比)。
注:テストは、トレーニングの間隔(少なくとも2日間)の間に数回繰り返すことができます。
3. 新規性誘発性低血圧検査の実施
- トレーニング期間の実施
注: テストを行う前に、1 日 30 分のトレーニング期間を 5 日間お勧めします (セットアップは 図 2を参照してください)。目的は、実験の前に味わい深いスナック摂取量の安定したベースラインを達成することです。動物が収容されている部屋のホームケージで行われます。- すべてのゲートを閉じて、標準的なチャウでホッパーを削除します。
- 新鮮なホッパーに味わい深いスナック(50g以上)を入れ替えます。クラッカーをホッパーに慎重に挿入して崩れないようにします。マイクロバランスの上にケージマウントにホッパーを置きます。
- ラットがスナックと水に アドリビタム にアクセスできるように、30分間ゲートを開きます。監視システムでのトレーニングの開始を文書化します。
注:ラットは、トレーニング期間中に標準的なチャウにアクセスする必要はありません。 - 30分後にゲートを閉じ、監視システムでトレーニングの終了を記録します。スナックを標準的なチャウに置き換えます。
- 1)安定したベースラインの味わい深いスナック摂取量(例えば、1.5-2.0 g/30分)と2)の摂取量がトレーニング日数によって統計的に異ならないまで、これを毎日繰り返します。
- 新規性誘発性低血圧検査の実施
- 自動食品摂取監視システムに取り付けられた寝具や濃縮なしで、空の清潔なケージを準備します。水道水のボトルとホッパーとケージマウントに味わい深いスナックを置きます。
注:新しいケージは、ラットが収容されているのと同じ部屋に置かれ、訓練を行う必要があります。ゲートを閉めておきなさい。 - ホームケージからラットを取り出し、新しいケージに入れます。
- すべてのゲートを30分間開きます。監視システムでのテストの開始を文書化します。
注:スナックへのアクセスの30分の間に、スナック摂取量のサイズと基礎となる微細構造パラメータ(例えば、最初の食事への待ち時間)は、自動化された食物摂取監視システムを使用して記録されます。 - 30分後にゲートを閉じ、テスト終了を文書化します。ネズミをホームケージに戻します。
注:テストは、トレーニングの間隔(少なくとも5日間)の間に数回繰り返すことができます。
- 自動食品摂取監視システムに取り付けられた寝具や濃縮なしで、空の清潔なケージを準備します。水道水のボトルとホッパーとケージマウントに味わい深いスナックを置きます。
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Representative Results
データ分布をテストするために、コルモゴロフスミルノフ試験を使用した。T検定は、データが正規分布し、Mann-Whitney-Uテストが使用されていない場合に使用されました。一方向の分散分析と、Tukey後ホックテストの後に、正規分布の多重グループ比較に使用した。非正規分布の場合には、一方向の分散分析とダンの多重比較検定が使用されました。グループ間の違いは 、p < 0.05 の場合に有意であると考えられました。
SPTは、この研究でナイーブラットに対して行われた。スクロース溶液の消費量が増加し、水の摂取量はトレーニング期間中に減少しました (図 3)。トレーニング初日、ラットは24.40mL±3.48mLのスクロース溶液(図3A)、4.83mL±通常水0.89mL(図3B)を飲み、スクロースの好み比0.80±0.06(図3C)を得た。Figure 3Aトレーニングの2日目に、 ラットはスクロース溶液の消費量を最大33.77mL±4.49mL(有意ではない、p = 0.17対.1日目)、水摂取量を0.42 mL±0.13 mL(p<0.001対.1)まで減少させ、0.99±0.004のp比率を得た。p図3C)。8匹のラットがここで研究された。したがって、各データポイントは8匹の動物から導き出されます。その微細構造を含む流体の摂取量は自動的に記録された。データは、データビューアを使用してPSC の合計から抽出されました。
60分試験中、動物は水を消費せずに0.91 mL±0.66(n=8)の平均値を有するスクロース溶液の0〜6.18mLの間で消費され、その結果、スクロースの好み比は0.99±0.00となった。試験中に液体を消費しなかった動物は分析から除外された。8匹のラットが研究された。流体摂取量を自動的に記録した。
自動摂取監視システムは、テスト中に自動的に評価されたスクロースの取り込み微細構造に関するデータを提供し、データビューアを使用してPSC Totalsから抽出した。これらのパラメータはFigure 4L、食事サイズ(図4A)、食事期間(図4B)、食事に費やされた時間(図4C)、およびパーセンテージ(図4D))、食事頻度(図4E)、食事間隔(図4F)、食事間隔(図4G)、飲酒率(図4H)、吹き出物持続時間(図4)、および4Lの割合)Figure 4J
自動摂取監視システムの利点をさらに研究するために、上記のデータを従来の手動評価を使用して得られたデータと比較した(トレーニング/テスト期間の前後に手動でボトルを計量する、表1)。訓練の初日には、スクロース(p<0.01)と水摂取量(p<0.01)は、自動と比較して手動で評価すると有意に高かった。pトレーニングの2日目には、水摂取量(p<0.001)とショ糖の好み率(p<0.01)が2つのグループと試験中に異なった。pすべてのパラメータ、すなわちショ糖摂取量(p<0.001)、水摂取量p(p<0.001)、およびスクロースの好み率(p<0.001)は、手動で評価された場合に誤って高い測定または流出のために、グループ間で異なっていた。p
トレーニング中の口当たりの良いスナックの全体的な摂取量は着実に増加しました:0.48g±0.14 g(1日目)、1.05g±0.32g(日2)、1.48g±0.56g(日3)、1.1g±0.39g(日4)、1.91g±0.68 g(日5)、1.2日目の適応を示す。同様に、食事のサイズはトレーニング日の間に増加傾向にある(図5A、p= 0.12)、食事の持続時間(p図5B)は(p>0.05)ではなかった。同様に、食事に費やされた時間(図5C)、最初の試合までの待ち時間(図5D)、試合サイズ(図5E)、試合時間(図5F)、バウトの数(図5H)など、他の微細構造パラメータは、これらの日Figure 5G(p>0.05)の間で有意に異ならなかった。8匹のラットが研究された。したがって、各データポイントは8匹の動物から導き出されます。微細構造を含むスナック摂取量は自動的に記録した。データは、データビューアを使用してPSC の合計から抽出されました。
試験日には、新しい環境でスナックにさらされたナイーブラットは、0.98g±0.34gの味わい深いスナックの摂取を示した(図6A)。食事の持続時間(図6B)、食事に費やした時間(図6C)、最初の試合までの待ち時間(図6D)、試合の長さ(図6F)、試合に費やされた時間(図6G)、およびバウトのFigure 6F数(図6H)を含む試験日の食物摂取微細構造のパラメータを、データビューアを使用してPSCの合計から自動的に評価し、抽出した。
新規性誘発性低血圧検査の特異性を研究するために、ナイーブラットおよびストレスを受けていないラットから上記のデータを、視床下部-下垂体副腎ストレス軸を刺激し、ストレスおよび不安を誘発するコルチコトロピン放出因子のイントレーレブロナーキュラー注射を受けたものと比較した。各動物の個々のデータは、プロトコルセクションに記載されているように、「データビューア」と「PSC Totals」を使用して取得した。その後、個々のデータを集計プログラムのグループ別に組み立て、統計的差異を分析しました。食事の大きさ(p<0.01)と吹き出しサイズ(p<0.01)の有意差が両方の群の間で検出された(表2)。pバウトサイズの違いは、手動評価を使用して検出できませんでした。
図1:スクロースの好みテストのセットアップこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:新規性誘発性低血圧検査のセットアップこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: ショ糖選好試験のトレーニング期間 スクロース溶液(A)と水(B)の消費量を24時間にわたって評価した。スクロースの選好率(C)はこれに応じて算出した。データは、8匹のラットからSEM±平均として提示されます(*p < 0.05, ***p < 0.001)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:スクロースプリファレンステスト試験日には、液体摂取微細構造(ここでは、 スクロース摂取量について示す)は、包含食事の大きさI(A)、食事期間(B)、食事に費やされた時間(C)、食事の数(D)、食事数D(E)、最初の食事までの待ち時間(F)、食事間隔(G)、飲酒率K(H)、およびLの中で過ごした時間についてJ1時間にわたって分析した。データは、SEM、n=8ラット±平均として提示される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:新規性誘発性低血圧検査のトレーニング期間食事の大きさ(A)、食事期間(B)、s(C)での食事に費やした時間、最初の発作(D)、試合の大Cきさ(E)、試合時間(F)、試合に費やされた時間(G)、および5日間の期間にわたってバウト(H)を評価した。Bデータは、SEM、n=8ラット±平均として提示される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6: 新規性誘発性低血圧検査試験日には、食物摂取細分構造を、含まれる食事サイズ(A)、食事期間(B)、食事(C)、第1発作までの待ち時間(D)、バウトサイズ(D)、バウト時間(F)、バウト(G)およびバウト数(H)について1時間にわたって分析した。データは、SEM、n=8ラット±平均として提示される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| パラメーター | 手動評価 | 自動摂取監視 |
| トレーニング期間(1日目) | ||
| スクロース摂取量(ml) | 63.46 ± 10.2 | 24.4 ± 3.48** |
| 水イナクテ(ml) | 12,07 ± 1,62 | 4.83 ± 0.89** |
| スクロースの選好比 | 0.83 ± 0,03 | 0.8 ± 0.06 |
| トレーニング期間(2日目) | ||
| スクロース摂取量(ml) | 45,49± 5,75 | 33.77 ± 4.49 |
| 水イナクテ(ml) | 4.92 ± 0,80 | 0.42 ± 0.13*** |
| スクロースの選好比 | 0.89 ± 0.02 | 0.99 ± 0.004** |
| ショ糖選好検定 | ||
| スクロース摂取量(ml) | 10.15 ± 0.53 | 2.91 ± 0.66**** |
| 水イナクテ(ml) | 6.65 ± 0.68 | 0 *** |
| スクロースの選好比 | 0.61 ± 0.04 | 0.99 ± 0.001*** |
表1:手動評価対自動摂取監視システムを用いたナイーブラットにおけるスクロース選好試験.データの分布は、コルモゴロフスミルノフ検定を用いて決定した。データは平均±SEMとして表され、差はデータの分布に応じてt検定またはMann-Whitney U検定を使用して分析された(* p<0.05,**p<0.01,***p;0.001対.マニュアル評価)。p p p
| パラメーター | ストレスを感じず | 強調 |
| (n=8) | (n=11) | |
| 食事サイズ (g/300g bw) | 0.98 ± 0.29 | 0.35 ± 0.07** |
| 食事の期間 (秒) | 998.29 ± 163.87 | 1209.11 ± 114.67 |
| 食事に費やされた時間 (秒) | 998.29 ± 163.87 | 989.27 ± 174.73 |
| 食事に費やされた時間 (%) | 55.46± 9.10 | 54.96 ± 9.71 |
| 最初の試合までの待機時間 (秒) | 241.25 ± 45.96 | 185.50 ± 57.52 |
| バウトサイズ (g) | 0.21 ± 0.03 | 0.08 ± 0.01** |
| 試合期間 (秒) | 70.70 ± 14.12 | 45.59 ± 4.20 |
| 試合に費やされた時間 (秒) | 439.75 ± 125.94 | 208.73 ± 45.01 |
| 試合に費やされた時間 (%) | 24.43 ± 7.00 | 11.6 ± 2.50 |
| バウト (番号) | 5.63 ± 0.67 | 4.64 ± 0.80 |
表2:ナイーブ無ストレスおよびストレス(CRF注入)ラットにおける新規誘発性低血圧検査。ストレス群では、icv-カニュー化ラットを0.6 μg/5 μL CRFで注射し、その後新規性誘発性低血圧症を起こした。データの分布は、コルモゴロフスミルノフ検定を用いて決定した。データの分布に応じて、t検定またはマン・ホイットニーU検定を使用して差を分析しました。比較可能性を高めるため、すべてのデータは SEM ±平均値として表現されます (**p < 0.01対.
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Discussion
スクロースの好みと新規性誘発性低phphagia検査は、ラットにおけるアンヘドニアを評価するための2つの確立された技術である。自動食品摂取監視システムとの組み合わせは、邪魔されないラットのより詳細な分析を可能にし、誤った測定を減らします。
エラーの発生率は、異なるアプローチによって減少します。まず、流出によるエラーに対処するために、フードホッパーとゲートの間のギャップは、かじり中に発生するパン粉が統合されたトレイに落ちるようにすることができます。ケージマウント上にこのこぼれを集めることによって、それらは測定に含まれる(こぼれはバランスに残っているので、測定に影響を与えない)。第二に、買いだめを防ぐために、ラットケージマウント開口部は、動物が開口部の中に頭を持つ食物ホッパーから食べることができるように十分な大きさですが、食べている間に動物が手を使用する能力を制限するのに十分小さいです。これは、食品を削除し、ケージにそれを持って来る能力を制限します。
第三に、システムは、プライミング後の液体ボトルが漏れ、蒸発が精密ステンレス鋼ボール/シッパーチューブ界面でゆっくりと(約<10 mg / h)だけ発生するため、意図しない液体の損失を低減します。また、システムは自動的にボトルの重量を量るので、記録中のボトルの取り扱いは必要ありません。これはエラーの一般的な原因です。手動測定と自動測定の比較(表1)の 違いは、ボトルの手動処理中に意図しない損失が原因であると考えられています。
自動食品摂取監視システムの使用は、固体および液体食品摂取量の詳細な分析および基礎となる食物摂取微細構造10の評価など、いくつかの利点を提供する。用語「微細構造」は、食物または流体摂取のパターンをより詳細に記述する。自動摂取監視システムのない研究では、摂取は、対象となる時点の開始時と終了時に食品/流体を計量することによって測定されます。このアプローチで得られる情報は、一定期間の総消費です。
これに対し、自動監視システムは、マイクロバランスの重みの変化を毎秒記録するため、この期間中の消費に関するより多くの情報を提供します。録音は、げっ歯類がいつ食べ始めるか、どのくらいの頻度で食べるか、どのくらいの時間食べるか、食べる量、食べる間の休憩時間などを詳しく説明することができます。手動測定を使用して自動化システムと同様のデータを取得するには、ユーザーはテスト/トレーニング中に頻繁にコンテンツを測定し、それによって動物を著しく妨害する必要があります。自動システムでは、げっ歯類はトレーニングセッションやテスト中に邪魔されないままです。
げっ歯類のために利用可能な自動化された取り込みシステムの多数を考慮すると、ここで説明するプロトコルに指定されたモデルは必要ないため重要です。しかし、このシステムは非常に敏感です。環境騒音(スケール上の質量の低レベル振動または揺れ)によるエラーを避けるために、システムのアルゴリズムは2秒ごとに収集された値を評価し、平均10の値を得るために「ノイズ」の設定点以下の値のみを受け入れます。システムがこのノイズしきい値を超えた場合、値は、給餌の吹き出しの計算に使用される安定した重みを計算するために使用されません。
テストの実行に関しては、いくつかの重要な点を念頭に置く必要があります。概日の変更は動物12,13,13の行動に影響を及ぼす可能性があるため、すべての行動検査は同じ時刻に行われるべきである。ほとんどの研究は光段階で行動テストを行い、ここではすべてのテストが暗位相の間に行われました。げっ歯類は夜行性の動物であり、したがって暗い段階で活動し、光相の間に探査活動13が低い12の活動を眠っている、 またはあまり活動していない。したがって、行動検査は、暗い写真期間中に生理学的に割り当てが行われます。
ショ糖選好検定では、0.5%~10%4、7、14の範囲で、異なる濃度のショ糖溶液が使用されている点に注意4,7,14することが重要です。それらは主に種、株、性別、年齢に応じて選択されますが、特に訓練中に観察された飲酒行動に基づいています(すべての動物は治療/介入の前にほぼ同じ量を飲むべきです)。しかし、高濃度(例えば、10%)うつ病のような行動を持つ動物でさえもまだ非常に甘い液体4を飲むので、アンヘドニアを上書きすることができます。
さらに、高濃度による高カロリー含有量は、より顕著にスクロース溶液の好みに影響を与える可能性があります。したがって、このプロトコルには1%のスクロース溶液が選ばれました。いくつかの研究は、任意のカロリーの影響を避けるために、スクロースの代わりにサッカリンの使用をお勧めします15. しかし、消費された糖溶液の消費量の平均カロリー含有量(1%スクロース溶液の2gは0.08kcalを含む)は、同量の標準チャウ(2gは7.8kcalを含む)よりもかなり低い。したがって、この点は二次的に見えます。
また、自動食品摂取監視システムを用いてここで評価したベースラインショ糖選好率は、手動評価を採用した以前の研究と比較して高い(0.99)ことに注意することも重要である(マウス8、若年成ラットでは0.8、高齢の雄のスプレイグ・ドーレーラットでは0.6)。これは、従来の計量がケージへの挿入および取り外し中に流体の損失を引き起こす可能性があるため、ボトルの取り扱いに起因する可能性があります。これは、 表1 に示す結果によってさらに立証される。したがって、自動監視システムの使用は、アンヘドニアの検出に適している場合があり、一方で、食物摂取のヘドニックな側面のさらなる刺激は、天井の影響のために見逃される可能性がある。
新規性誘発性低血圧検査に関しては、ラットがテストを行う前に口当たりの良いスナックの摂取のための安定したベースラインを開発できるようにすることが重要である。ラット内およびラット間で安定したベースラインに達した場合にのみ、実際のテストを行う必要があります。さもなければ、介入の効果(すなわち、薬物、ストレス等)が見逃されたり、ベースラインの変動が誤って解釈されたりする。また、新しいケージが低血圧を引き起こす新規性ストレスを誘発することを確認することも重要です。いくつかのプロトコルは、新しいケージの使用自体が十分であることを示唆しているが、ラットはしばしば毎週のケージの清掃/変更に使用されるため、以前は使用されていないが、寝具や濃縮を含むケージはストレスを誘発できない可能性があることを観察した。したがって、空の新しいケージを使用する必要があります。事前にテストした食品摂取も結果に影響を及ぼす可能性があるため、検査前に食物摂取量を監視する必要があります。これは、自動化された方法で簡単に行うことができます。
文献では、うつ病のような行動の異なる側面(しばしばアンヘドニアの代わりに絶望)を評価するために様々な代替テストが使用されています。しかし、この原稿の中に示す方法には、いくつかの利点があります。うつ病のような行動の一部として行動の絶望を評価するための代替の一般的に使用される方法は、強制水泳テスト4です。この場合、食品の消費は評価されません。したがって、不正確さを測定するリスクはありません。
このプロトコルには、他にもいくつかの欠点があります。最近のレビューでは、強制水泳テストは実際にストレス対処戦略を測定するテストであり、うつ病のような行動17ではないと結論付けました。また、動物福祉の「3つのR」に従って動物の数を減らすことがクロスオーバー設計が好ましい場合、強制泳ぎ試験は適用できず、試験動物18の行動に長期的な(外傷)効果を及ぼす可能性があるためである。
対照的に、SPTとNIHは両方とも外傷の側面を持たないし、繰り返すことができる。また、SPTとNIHの前のトレーニングフェーズは、消費に慣れ、したがって、プロトコルを繰り返し実行できます。テスト後、味わい深い食品(スクロース溶液またはスナック)を取り除き、試験後約24時間のトレーニングが再導入されます。したがって、げっ歯類は味わい深い刺激にアクセスせずに休憩を持っています。休憩後、1の周りの好み比を確保するために適応を伴う新しいトレーニング期間が発生するか、またはテストを繰り返す前に安定したベースラインスナック摂取量が達成されることを前提としています。
強制水泳試験と同様の試験は、尾部懸濁試験であり、動物が尾で中断され、うつ病のような行動の徴候として解釈される不動姿勢を発症する短期的で避けられないストレス期間である19。この試験は、ラットがより高い平均体重20のために尾で懸濁してはならないので、マウスでのみ使用することができ、SPTとNIHはマウスとラットの両方で使用することができる。
この原稿で提示されるテストのさらなる利点は、新規性誘発性低phagiaテストが良好な構造の有効性を示すことである。したがって、それは、その主張ウェル21、22,22まで測定します。その結果、消費される味わい性物質の量は、アンヘドニアの強度と相関し、SPTおよびNIHの結果の適合性によって他の行動テスト12との適合性によって裏付けられる。さらに、スクロース好性試験および新規性誘発性低血圧検査の両方が良好な顔の有効性を有する。それらは主観的に意図されているものを測定するものとして見られている(ここでは、アンヘドニアは、口当たり可能な物質の摂取量の減少として評価される)21,22。21,
自動摂取監視システムの主な制限事項は、システムの適切なトレーニングと毎日のメンテナンス/クリーニングの要件であり、手動プロトコルよりも労働集約的です。以前の実験10では、若いラットが自動化システムに適応するが、古いラットは時々適応しないことが観察されている。これらの動物は明らかに実験から除外されるべきです。
行動テストの限界に関しては、トレーニングも時間がかかり、特にNIHに言及する必要があります。さらに、プロトコルは両方とも短期的であり、長期的な適用は栄養失調につながる可能性があります。これまでのところ、文献は飢餓状態(例えば、うつ病の症状に一般的に関連する摂食障害である拒食症のモデル)におけるこれらの検査の使用を報告しないので、飢餓状態に対する彼らの使用の推奨はない。
このプロトコルを使用すると、アンヘドニア(流体/スナックの摂取量の減少)があるかどうかを検出することしかできません。しかし、アンヘドニアの程度を具体的に定量化することはできません。将来的には、異なるスクロース濃度を有するいくつかのボトルの導入は、アンヘドニアをさらに定量化するために可能な追加になる可能性があります。総合的に、自動摂取モニタリングの使用は、医薬品研究のために飲料水に溶解した薬の経口摂取をモニタリングするなど、摂取の正確な検出が必要な実験に有用であり得る。
要約すると、スクロース好みのテストと新規性誘発性低血圧検査は、げっ歯類におけるうつ病のような行動の一部としてアンヘドニアを評価するための確立されたプロトコルである。自動食品摂取監視システムと組み合わせると、微妙な違いさえも信頼性の高い反復性の高い方法で検出できます。
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Disclosures
A.S.はベルリン、ベーリンガー・インゲルハイム、武田、シュワベのコンサルタントです。利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、ドイツ研究財団(STE 1765/3-2)とシャリテ大学の資金援助(UFF 89/441-176、A.S.)の資金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Assembly LH Cage Mount - RAT-FOOD - includes Stainless cage mount, hopper, blocker, coupling | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCMPRF01 | |
| Assembly LH Cage Mount unplugged - RAT - FOOD includes stainless steel cage mount, hopper, blocker, unplugged adapter, coupling | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCMUPRF01 | |
| cage w/ 2 openings - RAT - costum modified cage - includes cage top and standard water bottle | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCR02 | single housing |
| Data collection Laptop Windows - Configured w/ BioDAQ Software | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BLT003 | |
| enrichment (plastic tubes, gnawing wood) | distributed by the animal facility | ||
| HoneyMaid Graham Cracker Crumbs | Nabisco, East Hanover, NJ, USA | ASIN: B01COWTA98 | palatable snack for NIH test |
| low vibration polymer rack | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BRACKR | |
| male Sprague Dawley rats | Envigo | Order Code: 002 | |
| Model #2210 32x Port BioDAQ Central Controller - includes cables, and calibration kit | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BCC32_03 | |
| Peripheral sensor Controller - includes cable | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BPSC01 | |
| SigmaStat 3.1 | Systat Software, San Jose, CA, USA | statistical analysis | |
| Stainless steel blocker | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | BBLKR | |
| standard rodent diet with 10 kcal% fat | Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA | D12450B | |
| sucrose powder | Roth | 4621.1 | for SPT |
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