High-Frequency Ultrasound Echocardiography om zebravissen cardiale functie te beoordelen
Summary
We beschrijven een protocol om hartmorfologie en functie bij volwassen zebravissen te beoordelen met behulp van hoogfrequente echocardiografie. De methode maakt visualisatie van het hart en de daaropvolgende kwantificering van functionele parameters mogelijk, zoals hartslag (HR), hartoutput (CO), fractionele gebiedsverandering (FAC), uitwerpfractie (EF) en bloedinstroom en uitstroomsnelheden.
Abstract
De zebravis (Danio rerio) is uitgegroeid tot een zeer populair model organisme in cardiovasculair onderzoek, met inbegrip van menselijke hartziekten, grotendeels te wijten aan de embryonale transparantie, genetische traktaat, en voorzieningen om snelle, high-throughput studies. Echter, het verlies van transparantie beperkt hartfunctie analyse in het volwassen stadium, die modellering van leeftijd-gerelateerde hartaandoeningen bemoeilijkt. Om dergelijke beperkingen te overwinnen, high-frequency echografie echocardiografie bij zebravissen is in opkomst als een haalbare optie. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om de hartfunctie bij volwassen zebravissen te beoordelen aan de hand van niet-invasieve echocardiografie met behulp van hoogfrequente echografie. De methode maakt visualisatie en analyse van zebravissen hartdimensie en kwantificering van belangrijke functionele parameters, met inbegrip van hartslag, slag volume, cardiale output, en uitwerping fractie. Bij deze methode worden de vissen verdoofd en onder water gehouden en kunnen ze na de procedure worden teruggewonnen. Hoewel hoogfrequente echografie een dure technologie is, kan hetzelfde beeldvormingsplatform worden gebruikt voor verschillende soorten (bijvoorbeeld murine en zebravissen) door verschillende transducers aan te passen. Zebravis echocardiografie is een robuuste methode voor cardiale fenotypering, nuttig bij de validatie en karakterisering van ziektemodellen, met name late-onset ziekten; drugsschermen; en studies van hartletsel, herstel en regeneratieve capaciteit.
Introduction
De zebravis(Danio rerio) is een gevestigd eikmodel voor studies naar ontwikkelingsprocessen en menselijke ziekten1. Zebravissen hebben een hoge genetische gelijkenis met de mens (70%), genetische traktatabiliteit, hoge vruchtbaarheid, en optische transparantie tijdens de embryonale ontwikkeling, die het mogelijk maakt directe visuele analyse van organen en weefsels, met inbegrip van het hart. Ondanks het feit dat slechts een atrium en een ventrikel, de zebravissen hart (Figuur 1) is fysiologisch vergelijkbaar met zoogdier vier-kamerharten. Belangrijk is dat de zebravis hartslag, elektrocardiogram morfologie, en actie potentiële vorm lijken op die van de mens meer dan murine soorten2. Deze kenmerken hebben zebravissen een uitstekend model voor cardiovasculair onderzoek en hebben belangrijke5inzichten in hartontwikkeling43,,4 , regeneratie 5 , en pathologische aandoeningen1,3,4, met inbegrip van aderverkalking, cardiomyopathies, hartritmestoornissen, aangeboren hartziekten, en amyloïde lichtketen cardiotoxiciteit1,4,6. Beoordeling van de hartfunctie is mogelijk geweest tijdens de embryonale fase (1-daagse na bevruchting) door middel van directe video-analyse met behulp van high-speed video microscopie7,8. Zebravissen verliezen echter hun transparantie na het embryonale stadium, waardoor functionele evaluaties van normale volwassen harten en late hartaandoeningen worden beperkt. Om deze beperking te overwinnen, echocardiografie is met succes gebruikt als een hoge resolutie, real-time, niet-invasieve beeldvorming alternatief voor de evaluatie van volwassen zebravissen hartfunctie9,10,11,12,13,14,15.
Bij zebravis bevindt het hart zich ventrally in de borstholte onmiddellijk achterstelijk aan de kieuwen met het atrium gelegen rugspier aan de ventrikel. Het atrium verzamelt veneuze bloed uit de sinus venosus en brengt het over naar de ventrikel waar het verder wordt gepompt naar de bulbus arteriosus (Figuur 1). Hier beschrijven we een fysiologisch, onderwaterprotocol om de cardiale functie bij volwassen zebravissen te beoordelen aan de hand van niet-invasieve echocardiografie met behulp van een lineaire array echografiesonde met een middenfrequentie van 50 MHz voor B-modus beeldvorming met een resolutie van 30 μm. Aangezien ultrasone golven gemakkelijk door water kunnen reizen, biedt het houden van de nabijheid tussen de vissen en de scansonde onderwater genoeg contactoppervlak voor hartdetectie zonder behoefte aan ultrasone gel en is over het algemeen minder belastend voor de vissen. Hoewel alternatieve zebravissen echocardiografie systemen werden gemeld door verschillende auteurs9,12,13, hier presenteren we de algemene en meest gebruikte setup die van toepassing is op hoge frequentie echografie bij dieren.
De methode maakt hoge resolutie beeldvorming van de volwassen zebravissen hart, het traceren van hartstructuren, en kwantificering van piek-snelheden van Doppler bloedstroom metingen. We tonen betrouwbare in vivo kwantificering van belangrijke systolische en diastolische parameters, zoals uitwerpfractie (EF), fractionele gebiedsverandering (FAC), ventriculaire bloedinstroom en uitstroomsnelheden, hartslag (HR) en cardiale output (CO). We dragen bij aan het vaststellen van een betrouwbaar scala aan normale gezonde volwassen zebravissen cardiale functionele en dimensionale parameters om een meer nauwkeurige evaluatie van pathologische toestanden mogelijk te maken. Over het algemeen bieden we een robuuste methode om de hartfunctie bij zebravissen te beoordelen, die zeer nuttig is gebleken bij het vaststellen en valideren van zebravissen hart-en vaatziekten modellen6,,16,hartletsel en herstel10,13, en regeneratie11,12, en kan verder worden gebruikt om potentiële geneesmiddelen te evalueren.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven een systematische methode voor echocardiografische beeldvorming en beoordeling van de hartfunctie bij volwassen zebravissen. Echocardiografie is de enige beschikbare niet-invasieve en meest robuuste methode voor levende volwassen vissen cardiale beeldvorming en functionele analyse, en het wordt steeds populairder in zebravissen cardiovasculair onderzoek. De benodigde tijd is kort en maakt een hoge doorvoer en longitudinale studies mogelijk. Er is echter een aanzienlijke variatie in de gebruikte methodologi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Fred Roberts’ technische ondersteuning en herziening van het manuscript.
Materials
| Double sided tape | |||
| Fish net | |||
| Glass container – 100 inch high | |||
| High frequency transducer | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm |
| Plastic teaspoon | |||
| Scalpel or scissors | |||
| Small fish tanks | |||
| Sponge (kitchen sponge) | |||
| Transfer pipets (graduated 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100 Imaging system and imaging station | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB sofware v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
References
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Verkerk, A. O., Remme, C. A. Zebrafish: a novel research tool for cardiac (patho)electrophysiology and ion channel disorders. Frontiers in Physiology. 3, 255 (2012).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular research. 91 (2), 279-288 (2011).
- Poon, K. L., Brand, T. The zebrafish model system in cardiovascular research: A tiny fish with mighty prospects. Global Cardiology Science and Practise. 2013 (1), 9-28 (2013).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Mishra, S., et al. Zebrafish model of amyloid light chain cardiotoxicity: regeneration versus degeneration. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (5), H1158-H1166 (2019).
- Shin, J. T., Pomerantsev, E. V., Mably, J. D., MacRae, C. A. High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish. Physiologycal Genomics. 42 (2), 300-309 (2010).
- Mishra, S., et al. Human amyloidogenic light chain proteins result in cardiac dysfunction, cell death, and early mortality in zebrafish. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 305 (1), H95-H103 (2013).
- Ernens, I., Lumley, A. I., Devaux, Y., Wagner, D. R. Use of Coronary Ultrasound Imaging to Evaluate Ventricular Function in Adult Zebrafish. Zebrafish. 13 (6), 477-480 (2016).
- González-Rosa, J. M., et al. Use of Echocardiography Reveals Reestablishment of Ventricular Pumping Efficiency and Partial Ventricular Wall Motion Recovery upon Ventricular Cryoinjury in the Zebrafish. PLoS One. 9 (12), (2014).
- Huang, C. C., Su, T. H., Shih, C. C. High-resolution tissue Doppler imaging of the zebrafish heart during its regeneration. Zebrafish. 12 (1), 48-57 (2015).
- Kang, B. J., et al. High-frequency dual mode pulsed wave Doppler imaging for monitoring the functional regeneration of adult zebrafish hearts. Journal of the Royal Society Interface. 12 (103), (2015).
- Lee, J., et al. Hemodynamics and ventricular function in a zebrafish model of injury and repair. Zebrafish. 11 (5), 447-454 (2014).
- Sun, L., Lien, C. L., Xu, X., Shung, K. K. In Vivo Cardiac Imaging of Adult Zebrafish Using High Frequency Ultrasound (45-75 MHz). Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (1), 31-39 (2008).
- Wang, L. W., Kesteven, S. H., Huttner, I. G., Feneley, M. P., Fatkin, D. High-Frequency Echocardiography- Transformative Clinical and Research Applications in Humans, Mice, and Zebrafish. Circulation Journal. 82 (3), 620-628 (2018).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Disease Models & Mechanisms. 10 (1), 63 (2017).
- Lee, L., et al. Functional Assessment of Cardiac Responses of Adult Zebrafish (Danio rerio) to Acute and Chronic Temperature Change Using High-Resolution Echocardiography. PLOS ONE. 11 (1), e0145163 (2016).
- Genge, C. E., et al., Nilius, B., et al. . Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 171, 99-136 (2016).
