제브라피시 심장 기능을 평가하는 고주파 초음파 심초음파
Summary
우리는 고주파 심초음파를 사용하여 성인 제브라피시의 심장 형태와 기능을 평가하는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 심장의 시각화를 허용하고 심장 박동 (HR), 심장 출력 (CO), 분수 영역 변화 (FAC), 배출 분획 (EF), 및 혈액 유입 및 유출 속도와 같은 기능적 매개 변수의 후속 정량화를 허용합니다.
Abstract
Zebrafish(Danio rerio)는배아 투명성, 유전 성 및 빠른 처리량 연구에 대한 편의성으로 인해 인간 심장 질환을 포함한 심혈관 연구에서 매우 인기있는 모델 유기체가되었습니다. 그러나, 투명성의 손실은 나이 관련 심혼 조건의 모델링을 복잡하게 하는 성인 단계에서 심장 기능 분석을 제한합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 제브라피시의 고주파 초음파 심초음파가 실행 가능한 옵션으로 부상하고 있습니다. 여기에서, 우리는 고주파 초음파를 사용하여 비침범성 심초음파에 의하여 성인 zebrafish에 있는 심장 기능을 평가하기 위하여 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 제브라피시 심장 치수의 시각화 및 분석과 심박수, 뇌졸중 량, 심장 출력 및 배출 분율을 포함한 중요한 기능 적 매개 변수의 정량화를 할 수 있습니다. 이 방법에서, 물고기는 마취및 수중 유지및 절차 후 복구 할 수 있습니다. 고주파 초음파는 고가의 기술이지만, 동일한 이미징 플랫폼은 다른 트랜스듀서를 적용하여 다른 종 (예를 들어, 뮤린과 제브라피시)에 사용할 수 있습니다. Zebrafish 심초음파는 심장 자형질에 대한 강력한 방법이며, 질병 모델, 특히 후기 발병 질병의 유효성 검사 및 특성화에 유용합니다. 약물 화면; 심장 부상의 연구, 복구, 및 재생 능력.
Introduction
제브라피쉬(Daniorerio)는발달 과정과 인간 질병에 대한 연구를 위한 잘 확립된 척추동물모델1. Zebrafish는 인간 (70 %), 유전 성, 높은 fecundity 및 배아 발달 중 광학 투명성과 높은 유전 적 유사성을 가지고 있으며, 이는 심장을 포함한 장기와 조직의 직접적인 시각적 분석을 가능하게합니다. 심방하나와 심실1개에 불과하지만, 제브라피쉬심장(그림 1)은포유류 4체강 심장과 생리적으로 유사하다. 중요한 것은, 제브라피쉬 심박수, 심전도 형태, 및 행동 전위 모양은 뮤린 종2보다더 많은 인간의 것과 유사합니다. 이러한 특징은 제브라피쉬를 심혈관 연구를 위한 훌륭한 모델로 만들었으며 심장 발달3,4,4재생5,병리학 적 조건1,33,4,동맥 경화증, 심근병증, 부정맥, 선천성 심장 질환 및 아밀로이드 경쇄 심장 독성,1,,4,,6에대한 주요 통찰력을 제공했습니다. 고속 비디오 현미경7,,8을이용한 직접 영상 분석을 통해 배아 단계(1일 후 수정)동안 심장 기능 평가가 가능하였다. 그러나, 얼룩말 물고기는 정상적인 성숙한 심혼 및 늦은 개시 심혼 조건의 기능적인 평가를 제한하는 배아 단계를 넘어 그들의 투명성을 분실합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 심초음파는 성인 제브라피쉬 심장 기능9,,,,,10,,11,,12,13,14,15를평가하기 위한 고해상도, 실시간, 비침습적 영상 대안으로 성공적으로 채택되었다.
제브라피시에서 심장은 심실에 위치한 심방이있는 심방과 함께 아가미의 바로 후부인 흉강 구멍에 통풍구에 있습니다. 심방은 부비동 정맥에서 정맥 혈액을 수집하고 더 전구 동맥에 펌핑되는 심실로 전송합니다(그림 1). 여기서, 우리는 30 μm의 해상도에서 B 모드 이미징을 위한 50 MHz의 중심 주파수를 가진 선형 배열 초음파 프로브를 사용하여 비침습적 심초음파에 의해 성인 제브라피시의 심장 기능을 평가하는 생리적, 수중, 프로토콜을 기술한다. 초음파파는 물을 통해 쉽게 이동할 수 있기 때문에 수중에서 물고기와 스캐닝 프로브 사이의 근접성을 유지하면 초음파 젤없이 심장 검출을위한 충분한 접촉 면을 제공하며 물고기에 대한 스트레스가 전반적으로 적습니다. 대체 제브라피시 심초음파 시스템은 여러 저자에 의해 보고되었지만9,12,,13,여기에서 우리는 동물의 고주파 초음파에 적용되는 일반적이고 가장 일반적으로 사용되는 설정을 제시합니다.
이 방법은 성인 제브라피시 심장의 고해상도 이미징, 심장 구조 추적 및 도플러 혈류 측정에서 피크 속도의 정량화를 허용합니다. 우리는 배출 분획 (EF), 분수 영역 변화 (FAC), 심실 혈액 유입 및 유출 속도, 심박수 (HR) 및 심장 출력 (CO)과 같은 중요한 수축기 및 확장기 매개 변수의 생체 내 정량화를 보여줍니다. 우리는 병리학 상태의 보다 정확한 평가를 허용하기 위하여 일반적인 건강한 성숙한 얼룩말 물고기 심장 기능 및 치수 매개변수의 믿을 수 있는 범위를 확립하는 것을 기여합니다. 전반적으로, 우리는 제브라피쉬 심장 질환 모델6,16,심장 손상 및 회복10,13,및 재생,11,,12,및 잠재적 인 약물을 평가하는 데 매우 유용하다는 것이 입증 된 제브라피시의 심장 기능을 평가하는 강력한 방법을 제공합니다.,
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 성체 얼룩말어에서 심장 기능의 심초음파 이미징 및 평가를위한 체계적인 방법을 설명합니다. 심초음파는 살아있는 성인 물고기 심장 화상 진찰 및 기능 분석을 위한 유일한 유효한 비침범성 및 가장 강력한 방법이고, zebrafish 심장 혈관 연구에서 점점 더 대중화되고 있습니다. 필요한 시간은 짧으며 높은 처리량과 세로 연구를 할 수 있습니다. 그러나 사용되는 방법론과 데이터 분석에는 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 프레드 로버츠의 기술 지원 및 원고의 개정에 감사드립니다.
Materials
| Double sided tape | |||
| Fish net | |||
| Glass container – 100 inch high | |||
| High frequency transducer | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm |
| Plastic teaspoon | |||
| Scalpel or scissors | |||
| Small fish tanks | |||
| Sponge (kitchen sponge) | |||
| Transfer pipets (graduated 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100 Imaging system and imaging station | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB sofware v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
References
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