Анализатор подструктуры: удобный для пользователя рабочий процесс для быстрого исследования и точного анализа клеточных тел в флуоресценции Микроскопия изображения
Summary
Мы представляем свободно доступный рабочий процесс, построенный для быстрого исследования и точного анализа клеточных тел в конкретных клеточных отсеках в изображениях флуоресценции микроскопии. Этот удобный рабочий процесс разработан на программном обеспечении с открытым исходным кодом Icy, а также использует функции ImageJ. Трубопровод доступен без знания в анализе изображений.
Abstract
Последнее десятилетие характеризовалось прорывами в методах флуоресценции микроскопии, иллюстрируемых улучшением пространственного разрешения, а также в методах визуализации живых клеток и высокопроизводительной микроскопии. Это привело к постоянному увеличению количества и сложности данных микроскопии для одного эксперимента. Поскольку ручной анализ данных микроскопии занимает очень много времени, субъективен и запрещает количественный анализ, автоматизация анализа биоизображений становится почти неизбежной. Мы создали информационный рабочий процесс под названием Substructure Analyzer, чтобы полностью автоматизировать анализ сигналов в биоизображениях из флуоресцентной микроскопии. Этот рабочий процесс разработан на удобной для пользователя платформе с открытым исходным кодом Icy и завершается функциональными работами от ImageJ. Она включает в себя предварительную обработку изображений для улучшения соотношения сигнала к шуму, индивидуальную сегментацию клеток (обнаружение границ клеток) и обнаружение/количественное число тел клеток, обогащенных определенными отсеками клеток. Основным преимуществом этого рабочего процесса является предложение сложных функций биовизионства пользователям без опыта анализа изображений через удобный интерфейс. Кроме того, он является высоко модульным и адаптирован к нескольким вопросам от характеристики ядерного/цитоплазмического транслокации до сравнительного анализа различных клеточных тел в различных клеточных подструктурах. Функциональность этого рабочего процесса иллюстрируется в ходе изучения Cajal (спиральный) органов в условиях окислительного стресса (ОС). Данные флуоресценции микроскопии показывают, что их целостность в клетках человека влияет через несколько часов после индукции ОС. Этот эффект характеризуется уменьшением ядра катина в характерные Каджаальные тела, связанное с нуклеоплазматическим перераспределением катина в увеличенное число меньших очагов. Центральная роль катушкина в обмене между компонентами CB и окружающей нуклеоплазмой предполагает, что индуцированное распространение катушки может повлиять на состав и функциональность Cajal Bodies.
Introduction
Легкая микроскопия и, в частности, флуоресценция микроскопии являются надежными и универсальными методами, обычно используемыми в биологических науках. Они дают доступ к точной локализации различных биомолекул, таких как белки или РНК, через их специфическую флуоресцентную маркировку. Последнее десятилетие характеризовалось быстрыми достижениями в области микроскопии и технологий визуализации, о чем свидетельствует Нобелевская премия по химии 2014 года, присужденная Эрику Бетцигу, Стефану У. Аду и Уильяму Е. Мёрнеру за разработку суперрешенной флуоресценции микроскопии (SRFM)1. SFRM обходит предел дифракции традиционной оптической микроскопии, чтобы привести его в наноимень. Улучшение таких методов, как live-imaging или подходы к скринингу высокой пропускной способности, также увеличивает количество и сложность данных для лечения каждого эксперимента. Большую часть времени исследователи сталкиваются с высокой неоднородной популяции клеток и хотят анализировать фенотипы на одноклеточном уровне.
Первоначально, анализы, такие как подсчет очагов были выполнены глазом, который предпочитается некоторыми исследователями, поскольку он обеспечивает полный визуальный контроль над процессом подсчета. Тем не менее, ручной анализ таких данных является слишком трудоемким, приводит к изменчивости между наблюдателями, и не дает доступа к более сложным функциям, так что компьютерные подходы становятся широко используемыми и почтинеизбежными 2. Методы информатизации bioimage существенно повышают эффективность анализа данных и свободны от неизбежной субъективности оператора и потенциальной предвзятости ручного анализа подсчета. Повышенный спрос в этой области и совершенствование вычислительной мощности привели к разработке большого количества платформ анализа изображений. Некоторые из них находятся в свободном доступе и предоставляют доступ к различным инструментам для проведения анализа с помощью персональных компьютеров. Классификация инструментов открытого доступа была недавно создана3 и представляет Icy4 как мощное программное обеспечение, сочетающее удобство использования и функциональность. Кроме того, Icy имеет преимущество общения с ImageJ.
Для пользователей без экспертизы анализа изображений, основные препятствия, чтобы выбрать соответствующий инструмент в соответствии с проблематичным и правильно настроить параметры, которые часто не очень хорошо понимают. Кроме того, время установки часто длинные. Icy предлагает удобный интерфейс «Протоколы» для разработки рабочего процесса, объединив некоторые плагины, найденные в исчерпывающей коллекции4. Гибкая модульная конструкция и интерфейс точки и щелчка делают настройку анализа возможной для непрограммистов. Здесь мы представляем рабочий процесс под названием Substructure Analyzer,разработанный в интерфейсе Icy, функция которого заключается в анализе флуоресцентных сигналов в конкретных сотовых отсеках и измерении различных функций, таких как яркость, число очагов, размер очагов и пространственное распределение. Этот рабочий процесс решает несколько вопросов, таких как количественная оценка транслокации сигнала, анализ трансфицированных клеток, выражающих флуоресцентный репортер, или анализ очагов из различных клеточных подструктур в отдельных клетках. Это позволяет одновременно обрабатывать несколько изображений, а результаты вывода экспортируются в таблицу, делимитированную в вкладке, которая может быть открыта в часто используемых программах электронных таблиц.
Конвейер Substructure Analyzer представлен на рисунке 1. Во-первых, все изображения, содержащиеся в указанной папке, предварительно обработаны для улучшения их соотношения сигнала к шуму. Этот шаг повышает эффективность следующих шагов и уменьшает время работы. Затем идентифицируются и сегментируются регионы интересов (ROIs), соответствующие области изображения, где должен быть обнаружен флуоресцентный сигнал. Наконец, анализируется флуоресцентный сигнал, и результаты экспортируются в таблицу, делимитированную в вкладке.
Сегментация объектов (обнаружение границ) является наиболее сложным шагом в анализе изображений, и его эффективность определяет точность полученных измерений клеток. Первые объекты, идентифицированные на изображении (так называемые первичные объекты), часто являются ядрами из изображений, окрашенных ДНК (DAPI или Hoechst окрашивания), хотя основными объектами также могут быть целые клетки, бусы, пятнышки, опухоли, или любой другой окрашенных объектов. В большинстве биологических изображений клетки или ядра прикасаются друг к другу или перекрываются, вызывая сбой простых и быстрых алгоритмов. На сегодняшний день ни один универсальный алгоритм не может выполнить идеальную сегментацию всех объектов, в основном потому, что их характеристики (размер, форма или текстура) модулируют эффективность сегментации5. Инструменты сегментации, широко распространяемые с помощью программного обеспечения микроскопии (например, программное обеспечение MetaMorph Imaging Software by Molecular Devices6, или NIS-Elements Advances Research Software от Nikon7),как правило, основаны на стандартных методах, таких как корреляция, пороговые или морфологические операции. Хотя эти методы чрезмерно обобщенных методов эффективны в своих основных системах, они быстро обувкут ограничения при использовании в более сложных и специфических условиях. Действительно, сегментация очень чувствительна к экспериментальным параметрам, таким как тип клеток, плотность клеток или биомаркеры, и часто требует повторной корректировки для большого набора данных. Рабочий процесс Substructure Analyzer интегрирует как простые, так и более сложные алгоритмы, чтобы предложить различные альтернативы, адаптированные к сложности изображения и потребностям пользователей. Он, в частности, предлагает маркер основе водораздела алгоритм8 для высокогруппиборированных объектов. Эффективность этого метода сегментации зависит от выбора отдельных маркеров на каждом объекте. Эти маркеры вручную выбираются большую часть времени, чтобы получить правильные параметры для полной сегментации, что очень много времени, когда пользователи сталкиваются с большим количеством объектов. Подструктурный анализатор предлагает автоматическое обнаружение этих маркеров, обеспечивая высокоэффективный процесс сегментации. Сегментация в большинстве случаев является ограничивающим этапом анализа изображений и может значительно изменять время обработки в зависимости от разрешения изображения, количества объектов на изображение и уровня кластеризации объектов. Типичные трубопроводы требуют от нескольких секунд до 5 минут на изображение на стандартном настольном компьютере. Анализ более сложных изображений может потребовать более мощного компьютера и некоторых базовых знаний в анализе изображений.
Гибкость и функциональность этого рабочего процесса иллюстрируются различными примерами в репрезентативных результатах. Преимущества этого рабочего процесса особенно проявляются в изучении ядерных подструктур в условиях окислительного стресса (ОС). ОС соответствует дисбалансу редокса гомеостаза в пользу окислителей и связана с высоким уровнем реактивных видов кислорода (ROS). Так как ROS выступает в качестве сигнальных молекул, изменения в их концентрации и субклеточной локализации влияют положительно или отрицательно множество путей и сетей, которые регулируют физиологические функции, в том числе трансдукции сигнала, механизмы ремонта, экспрессия генов, гибель клеток, и пролиферация9,10. Таким образом, ОС непосредственно участвует в различных патологиях (нейродегенеративных и сердечно-сосудистых заболеваний, рака, диабета и т.д.), но и клеточного старения. Поэтому расшифровка последствий ОС для организации и функции человеческой клетки представляет собой важнейший шаг в понимании роли ОС в наступлении и развитии патологий человека. Установлено, что ОС регулирует экспрессию генов, модулируя транскрипцию через несколько транскрипционных факторов (p53, Nrf2, FOXO3A)11,но также, влияя на регулирование нескольких со-и пост-транскрипционных процессов, таких как альтернативное сплайсирование (AS) предварительно РНК12,,13,,14. Альтернативное сращивание первичных кодирования и некодирующих стенограмм является важным механизмом, который увеличивает способность кодирования геномов, производя трансформы транскрипта. AS выполняется огромный комплекс рибонуклеопротеинов называется сплайсесома, содержащий почти 300 белков и 5 U-богатых малых ядерных РНК (UsnRNAs)15. Спласиосомная сборка и AS жестко контролируются в клетках, и некоторые этапы созревания сплайсесомы происходят в мембранных менее ядерных отсеках под названием Cajal Bodies. Эти ядерные подструктуры характеризуются динамическим характером их структуры и их составом, которые в основном проводятся многовалентными взаимодействиями их РНК и белковых компонентов с белком катушкина. Анализ тысяч клеток с помощью рабочего процесса Substructure Analyzer позволил охарактеризовать никогда не описанные эффекты ОС на телах Cajal. Действительно, полученные данные свидетельствуют о том, что ОС изменяет нуклеацию Cajal органов, вызывая нуклеоплазмического перераспределения белка coilin в многочисленных небольших ядерных очагов. Такое изменение структуры Cajal органов может повлиять на созревание сращивания и участвовать в модуляции AS ОС.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для анализа изображений флуоресценций клетки имеется все большее число свободных программных средств. Пользователи должны правильно выбирать адекватное программное обеспечение в соответствии со сложностью их проблематично, к их знаниям в обработке изображений, и к времени, которое ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Г.Х. был поддержан дипломом магистра в Министере Делегуэ а-ля Рехерш и Aux Технологии. Л.Х. был поддержан стипендией выпускника в Институте де Канчериотии Лотарингии (ICL), в то время как З.Т. был поддержан государственным грантом под надзором Французского национального исследовательского агентства (ANR) в рамках второй программы FIGHT-HF (справка: ANR-15-RHU457004). Эта работа была профинансирована CNRS и Университетом Лотарингии (UMR 7365).
Materials
| 16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | to fix the cells |
| Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21425 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A34055 | fluorescent secondary antibody |
| Bovine serum albumin standard (BSA) | euromedex | 04-100-812-E | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796-500ml | cell culture medium |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040-5ML | mounting medium |
| Human: HeLa S3 cells | IGBMC, Strasbourg, France | cell line used to perform the experiments | |
| Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2) | Sigma-Aldrich | H1009-100ml | used as a stressing agent |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | transfection reagent |
| Mouse monoclonal anti-coilin | abcam | ab11822 | Coilin-specific antibody |
| Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope | Nikon | epifluoresecence microscope | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | transfection medium |
| PBS pH 7.4 (10x) | gibco | 70011-036 | to wash the cells |
| Rabbit polyclonal anti-53BP1 | Thermo Fisher Scientific | PA1-16565 | 53BP1-specific antibody |
| Rabbit polyclonal anti-EDC4 | Sigma-Aldrich | SAB4200114 | EDC4-specific antibody |
| Triton X-100 | Roth | 6683 | to permeabilize the cells |
References
- Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner. Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).
- Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -. C. Imagining the future of bioimage analysis. Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).
- Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., Münzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
- de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
- Girish, V., Vijayalakshmi, A. Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ. Indian J Cancer. 41 (1), 47 (2004).
- Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. Survey on image segmentation techniques. Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).
- . MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software Available from: https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy (2018)
- . NIS-Elements Imaging Software Available from: https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element (2014)
- Meyer, F., Beucher, S. Morphological segmentation. Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- D’Autréaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).
- Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D’Arca, D. ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127 (2016).
- Disher, K., Skandalis, A. Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53. Genome. 50 (10), 946-953 (2007).
- Takeo, K., et al. Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2β (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).
- Seo, J., et al. Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene. PLOS ONE. 11 (4), 0154390 (2016).
- Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome Structure and Function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
- Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. Annotated high-throughput microscopy image sets for validation. Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).
- Wang, Q., et al. Cajal bodies are linked to genome conformation. Nature Communications. 7, (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7, 100 (2006).
- McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).
