Alt Yapı Analizörü: Floresan Mikroskopi Görüntülerinde HücreCisimlerinin Hızlı Araştırılması ve Doğru Analizi için Kullanıcı Dostu İş Akışı
Summary
Floresan mikroskopi görüntülerinde belirli hücre bölmelerinde hücresel cisimlerin hızlı araştırılması ve doğru analizi için oluşturulmuş serbestçe kullanılabilir bir iş akışı salıyoruz. Bu kullanıcı dostu iş akışı açık kaynak yazılım Icy üzerinde tasarlanmıştır ve aynı zamanda ImageJ işlevleri kullanır. Boru hattı görüntü analizi nde bilgi olmadan uygun fiyatlı.
Abstract
Son on yılda floresan mikroskopi tekniklerinde uzamsal çözünürlük iyileştirmesi ile gösterildiği gibi canlı hücre görüntüleme ve yüksek işlem mikroskobu tekniklerinde de atılımlar ile karakterize edilmiştir. Bu, tek bir deney için mikroskopi verilerinin miktarında ve karmaşıklığında sürekli bir artışa yol açmıştır. Mikroskopi verilerinin manuel analizi çok zaman alıcı, öznel ve nicel analizleri yasakladığı için, biyogörüntü analizinin otomasyonu neredeyse kaçınılmaz hale gelmektedir. Floresan mikroskopiden biyogörüntülerde sinyal analizini tam olarak otomatikleştirmek için Alt Yapı Analizörü adı verilen bir bilişim iş akışı kurduk. Bu iş akışı kullanıcı dostu açık kaynak platformu Icy üzerinde geliştirilmiştir ve ImageJ işlevleri tarafından tamamlanır. Sinyalin gürültü oranına doğru geliştirilmesi için görüntülerin ön işlenmesini, hücrelerin bireysel bölümlemesi (hücre sınırlarının saptanması) ve belirli hücre bölmelerinde zenginleştirilmiş hücre gövdelerinin algılanmasını/nicelleştirilmesini içerir. Bu iş akışının en büyük avantajı, kullanıcı dostu bir arayüz aracılığıyla görüntü analizi uzmanlığı olmayan kullanıcılara karmaşık biyo-görüntüleme işlevleri önermektir. Ayrıca, son derece modüler ve farklı hücresel alt yapılarda farklı hücre organlarının karşılaştırmalı analizi nükleer / sitoplazmik translokasyon karakterizasyonu çeşitli konulara adapte. Bu iş akışının işlevselliği oksidatif stres (OS) koşulları altında Cajal (kıvrılmış) Organların çalışması ile gösterilmiştir. Floresan mikroskopiden elde edilen veriler, insan hücrelerindeki bütünlüklerinin işletim sistemi indüksiyonundan birkaç saat sonra etkilendiğini göstermektedir. Bu etki karakteristik Cajal Cisimler içine bobin nükleasyonu bir azalma ile karakterizedir, küçük foci artan sayıda bobin bir nükleoplazmik yeniden dağılımı ile ilişkili. CB bileşenleri ile çevresindeki nükleoplazm arasındaki değişimde bobinin merkezi rolü, OS’nin indüklenen bobinin yeniden dağılımının Cajal Cisimlerinin bileşimini ve işlevselliğini etkileyebileceğini düşündürmektedir.
Introduction
Işık mikroskobu ve özellikle floresan mikroskobu biyolojik bilimlerde yaygın olarak kullanılan sağlam ve çok yönlü tekniklerdir. Proteinler veya RNA gibi çeşitli biyomoleküllerin spesifik floresan etiketlemeyoluyla kesin lokalizasyonuna erişim verirler. Son on yılda mikroskobik ve görüntüleme teknolojilerinde hızlı gelişmeler ile karakterize edilmiştir 2014 Nobel Kimya Ödülü Eric Betzig, Stefan W. Hell ve William E. Moerner süper çözülmüş1floresan mikroskopi mikroskobu (SRFM) gelişimi için verilen . SFRM, geleneksel optik mikroskopinin kırınım sınırını atlayarak nanoboyuta getirir. Canlı görüntüleme veya yüksek iş elde tarama yaklaşımları gibi tekniklerde iyileşme, her deney için tedavi edilmesi gereken verilerin miktarını ve karmaşıklığını da artırır. Çoğu zaman, araştırmacılar hücrelerin yüksek heterojen popülasyonları ile karşı karşıya ve tek hücre düzeyinde fenotipleri analiz etmek istiyorum.
Başlangıçta, foci sayma gibi analizler göz tarafından yapılmıştır ve bu durum bazı araştırmacılar tarafından tercih edilir, çünkü sayım süreci üzerinde tam görsel kontrol sağlar. Ancak, bu tür verilerin manuel analizi çok zaman alıcı, gözlemciler arasında değişkenlik yol açar ve bilgisayar destekli yaklaşımlar yaygın olarak kullanılan ve neredeyse kaçınılmaz hale geliyor böylece daha karmaşık özelliklere erişim vermez2. Biyogörüntü bilişim yöntemleri veri analizinin verimliliğini önemli ölçüde artırır ve manuel sayma analizinin kaçınılmaz operatör öznelliği ve potansiyel önyargısı içermez. Bu alandaki artan talep ve bilgisayar gücünün iyileştirilmesi çok sayıda görüntü analiz platformunun geliştirilmesine yol açmıştır. Bazıları serbestçe kullanılabilir ve kişisel bilgisayarlarla analiz yapmak için çeşitli araçlara erişim sağlar. Açık erişim araçları bir sınıflandırma son zamanlarda3 kurulmuştur ve kullanılabilirlik ve işlevselliği birleştiren güçlü bir yazılım olarak Icy4 sunar. Ayrıca, Icy ImageJ ile iletişim avantajı vardır.
Görüntü analizi uzmanlığı olmayan kullanıcılar için, ana engeller genellikle iyi anlaşılamayan sorunlu ve doğru ayar parametrelerine göre uygun aracı seçmektir. Ayrıca, kurulum süreleri genellikle uzun. Buzlu kapsamlı bir koleksiyon içinde bulunan bazı eklentileri birleştirerek iş akışı geliştirmek için “Protokoller” adlı kullanıcı dostu nokta ve tıklama arayüzü önerir4. Esnek modüler tasarım ve nokta-ve-tık arabirimi, programcı olmayanlar için bir analiz ayarlamayı mümkün kılabilir. Burada, işlevi belirli hücresel bölmelerde floresan sinyalleri analiz etmek ve parlaklık, foci sayısı, foci boyutu ve uzamsal dağılım gibi farklı özellikleri ölçmek olan Icy’nin arayüzünde geliştirilen Alt Yapı Analizörüadlı bir iş akışı salıyoruz. Bu iş akışı, sinyal translokasyonunun niceliği, floresan muhabiri ifade eden transfected hücrelerin analizi veya tek tek hücrelerdeki farklı hücresel alt yapılardan gelen fokların analizi gibi çeşitli konuları ele almaktadır. Birden çok görüntünün eşzamanlı olarak işlenmesine olanak tanır ve çıktı sonuçları, sık kullanılan elektronik tablo programlarında açIlebilen sekme sınırlandırılmış bir çalışma sayfasına dışa aktarılır.
Alt Yapı Çözümleyici boru hattı Şekil 1’desunulmuştur. İlk olarak, belirli bir klasörde bulunan tüm görüntüler, sinyallerini gürültü oranına göre geliştirmek için önceden işlenir. Bu adım, aşağıdaki adımların verimliliğini artırır ve çalışma süresini azaltır. Daha sonra, floresan sinyalinin algılandığı görüntü alanlarına karşılık gelen İlgi Bölgeleri (ROI’ ler) tanımlanır ve bölümlere alınır. Son olarak, floresan sinyali analiz edilir ve sonuçlar sekme-delimited çalışma sayfasına dışa aktarılır.
Nesne bölümlemesi (sınırların saptanması) görüntü analizinde en zorlu adımdır ve verimliliği elde edilen hücre ölçümlerinin doğruluğunu belirler. Bir görüntüde tanımlanan ilk nesneler (birincil nesneler olarak adlandırılır) genellikle DNA lekeli görüntülerden (DAPI veya Hoechst boyama) çekirdeklerdir, ancak birincil nesneler de bütün hücreler, boncuklar, benekler, tümörler veya lekeli nesneler olabilir. Biyolojik görüntülerin çoğunda hücreler veya çekirdekler birbirine dokunur veya örtüşarak basit ve hızlı algoritmaların başarısız olmasıyla oluşur. Bugüne kadar, hiçbir evrensel algoritma tüm nesnelerin mükemmel segmentasyon gerçekleştirebilirsiniz, çoğunlukla çünkü özellikleri (boyut, şekil veya doku) segmentasyon etkinliğini modüle5. Genellikle mikroskop yazılımı ile dağıtılan segmentasyon araçları (Moleküler Cihazlar tarafından MetaMorf Görüntüleme Yazılımıgibi 6, veya Nikon7tarafından NIS-Elements Advances Araştırma yazılımı) genellikle korelasyon eşleştirme, eşik veya morfolojik işlemler gibi standart tekniklere dayanmaktadır. Temel sistemlerde verimli olmasına rağmen, bu aşırı genelleştirilmiş yöntemler daha zorlu ve belirli bağlamlarda kullanıldığında hızla sınırlamalar sunar. Gerçekten de, segmentasyon hücre tipi, hücre yoğunluğu veya biyobelirteçler gibi deneysel parametrelere karşı son derece hassastır ve sık sık büyük bir veri kümesi için tekrarlanan ayarlama gerektirir. Alt Yapı Çözümleyici iş akışı, görüntü karmaşıklığına ve kullanıcı gereksinimlerine uyarlanmış farklı alternatifler önermek için hem basit hem de daha gelişmiş algoritmaları bütünleştirir. Yüksek kümelenmiş nesneler için işaretçi tabanlı havzaalgoritması 8’i özellikle önerir. Bu segmentasyon yönteminin verimliliği, her nesneüzerinde tek tek işaretçilerin seçimine dayanır. Bu işaretçiler, tam segmentasyon için doğru parametreleri elde etmek için çoğu zaman el ile seçilir, bu da kullanıcıların çok sayıda nesneyle karşılaştığında çok zaman alır. Alt Yapı Çözümleyicisi, yüksek verimli bir segmentasyon işlemi sağlayarak bu işaretçilerin otomatik olarak algılanmasını önerir. Segmentasyon, çoğu zaman, görüntü çözümlemesi sınırlayıcı adım ve önemli ölçüde görüntünün çözünürlüğü, görüntü başına nesne sayısı ve nesnelerin kümeleme düzeyine bağlı olarak işlem süresini değiştirebilirsiniz. Tipik ardışık hatlar, standart bir masaüstü bilgisayarda görüntü başına birkaç saniye ile 5 dakika arasında bir süre gerektirir. Daha karmaşık görüntülerin analizi daha güçlü bir bilgisayar ve görüntü analizi nde bazı temel bilgiler gerektirebilir.
Bu iş akışının esnekliği ve işlevselliği temsili sonuçlarda çeşitli örneklerle gösterilmiştir. Bu iş akışının avantajları özellikle oksidatif stres (OS) koşulları altında nükleer alt yapıların incelenmesi ile görüntülenir. Os oksidanlar lehine redoks homeostazı bir dengesizlik karşılık gelir ve reaktif oksijen türlerinin yüksek düzeyde ile ilişkilidir (ROS). ROS sinyal molekülleri olarak hareket ettiği için, konsantrasyonlarındaki ve hücre altı lokalizasyonlarındaki değişiklikler, sinyal iletimi, onarım mekanizmaları, gen ekspresyonu, hücre ölümü ve çoğalma9,10gibi fizyolojik fonksiyonları düzenleyen sayısız yolu ve ağı olumlu veya olumsuz yönde etkiler. İşletim sistemi böylece doğrudan çeşitli patolojiler (nörodejeneratif ve kardiyovasküler hastalıklar, kanserler, diyabet, vb) değil, aynı zamanda hücresel yaşlanma yer almaktadır. Bu nedenle, işletim sistemi’nin insan hücresinin organizasyonu ve işlevi üzerindeki sonuçlarının deşifre edilmesi, insan patolojilerinin başlangıcında ve gelişiminde os’un rollerinin anlaşılmasında önemli bir adım teşkil etmektedir. İşletim sistemi çeşitli transkripsiyon faktörleri (p53, Nrf2, FOXO3A)11ile transkripsiyon modüle ederek gen ekspresyonunu düzenler, ancak aynı zamanda alternatif rnas12,13,14alternatif birleştirme (AS) gibi çeşitli co- ve post-transkripsiyonel süreçlerin düzenlenmesini etkileyerek kurulmuştur .14 Birincil kodlama ve kodlamayan transkriptlerin alternatif olarak birleştirilmesi, transkript izoformları üreterek genomların kodlama kapasitesini artıran temel bir mekanizmadır. AS, yaklaşık 300 protein ve 5 U-zengin küçük nükleer RNA (UsnRNA) içeren spliceosome adı verilen büyük bir ribonükleoprotein kompleksi tarafından gerçekleştirilir15. Spliceosome montaj ve AS sıkıca hücrelerde kontrol edilir ve spliceosome olgunlaşma bazı adımlar Cajal Bodies adlı membran-az nükleer bölmeleri içinde meydana gelir. Bu nükleer alt yapılar, yapılarının dinamik yapısı ve bileşimi ile karakterizedir ve bunlar esas olarak RNA ve protein bileşenlerinin bobin proteini ile çok yönlü etkileşimleri ile gerçekleştirilir. Alt Yapı Çözümleyici iş akışı ile binlerce hücrenin analizi, os’un Cajal Cisimler üzerindeki hiçbir zaman tanımlanmamış etkilerinin karakterizasyonuna olanak sağladı. Gerçekten de elde edilen veriler, OS’lerin Cajal Cisimlerinin çekirdekleşmesini modicikçe modiciye dönüştürerek bobin proteininin nükleoplazmik olarak çok sayıda daha küçük nükleer fosiye ye dönüşmesini indüklediğini göstermektedir. Cajal Bodies yapısının böyle bir değişiklik spliceosome olgunlaşmasını etkileyebilir ve OS tarafından AS modülasyonu katılmak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Floresan hücre görüntülerinin analizi için giderek artan sayıda özgür yazılım aracı mevcuttur. Kullanıcılar, sorunlu larının karmaşıklığına, görüntü işlemedeki bilgilerine ve analizlerinde harcamak istedikleri zamana göre yeterli yazılımı doğru bir şekilde seçmelidir. Buzlu, CellProfiler veya ImageJ /Fiji hem kullanılabilirlik hem de işlevselliği birleştiren güçlü araçlardır3. Icy net bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) sunan tek başına bir araçtır, v…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
G.H., Ministère Délégué à la Recherche et aux Technologies’den lisansüstü burs ile desteklenmiştir. L.H. Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL) tarafından lisansüstü burs ile desteklenirken, Q.T. ikinci “Investissements d’Avenir” programı FIGHT-HF(referans: ANR-15-RHU4570004) kapsamında Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR) tarafından denetlenen bir kamu hibesi tarafından desteklendi. Bu çalışma CNRS ve Université de Lorraine (UMR 7365) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | to fix the cells |
| Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21425 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A34055 | fluorescent secondary antibody |
| Bovine serum albumin standard (BSA) | euromedex | 04-100-812-E | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796-500ml | cell culture medium |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040-5ML | mounting medium |
| Human: HeLa S3 cells | IGBMC, Strasbourg, France | cell line used to perform the experiments | |
| Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2) | Sigma-Aldrich | H1009-100ml | used as a stressing agent |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | transfection reagent |
| Mouse monoclonal anti-coilin | abcam | ab11822 | Coilin-specific antibody |
| Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope | Nikon | epifluoresecence microscope | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | transfection medium |
| PBS pH 7.4 (10x) | gibco | 70011-036 | to wash the cells |
| Rabbit polyclonal anti-53BP1 | Thermo Fisher Scientific | PA1-16565 | 53BP1-specific antibody |
| Rabbit polyclonal anti-EDC4 | Sigma-Aldrich | SAB4200114 | EDC4-specific antibody |
| Triton X-100 | Roth | 6683 | to permeabilize the cells |
References
- Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner. Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).
- Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -. C. Imagining the future of bioimage analysis. Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).
- Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., Münzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
- de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
- Girish, V., Vijayalakshmi, A. Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ. Indian J Cancer. 41 (1), 47 (2004).
- Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. Survey on image segmentation techniques. Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).
- . MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software Available from: https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy (2018)
- . NIS-Elements Imaging Software Available from: https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element (2014)
- Meyer, F., Beucher, S. Morphological segmentation. Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- D’Autréaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).
- Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D’Arca, D. ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127 (2016).
- Disher, K., Skandalis, A. Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53. Genome. 50 (10), 946-953 (2007).
- Takeo, K., et al. Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2β (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).
- Seo, J., et al. Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene. PLOS ONE. 11 (4), 0154390 (2016).
- Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome Structure and Function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
- Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. Annotated high-throughput microscopy image sets for validation. Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).
- Wang, Q., et al. Cajal bodies are linked to genome conformation. Nature Communications. 7, (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7, 100 (2006).
- McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).
