Mesure en temps réel de la migration et de l’invasion des cellules cancéreuses
Summary
Le cancer est une maladie mortelle en raison de sa capacité à métastaser à différents organes. Déterminer la capacité des cellules cancéreuses à migrer et à envahir dans diverses conditions de traitement est crucial pour évaluer les stratégies thérapeutiques. Ce protocole présente une méthode pour évaluer les capacités métastatiques en temps réel d’une lignée de cellules cancéreuses de glioblastome.
Abstract
Le cancer survient en raison de la prolifération incontrôlée des cellules initiées par l’instabilité génétique, les mutations, et l’environnement et d’autres facteurs de stress. Ces anomalies acquises dans les réseaux de signalisation moléculaire complexes et multicouches induisent la prolifération et la survie aberrantes de cellules, la dégradation extracellulaire de matrice, et la métastase aux organes éloignés. On estime qu’environ 90 % des décès liés au cancer sont causés par les effets directs ou indirects de la dissémination métastatique. Par conséquent, il est important d’établir un système très fiable et complet pour caractériser les comportements des cellules cancéreuses sur les manipulations génétiques et environnementales. Un tel système peut donner une compréhension claire de la régulation moléculaire des métastases cancéreuses et la possibilité de développer avec succès des stratégies thérapeutiques stratifiées et précises. Par conséquent, une détermination précise des comportements des cellules cancéreuses telles que la migration et l’invasion avec gain ou perte de fonction du gène(s) permet d’évaluer la nature agressive des cellules cancéreuses. Le système de mesure en temps réel basé sur l’impédance cellulaire permet aux chercheurs d’acquérir continuellement des données au cours d’une expérience entière et de comparer et de quantifier instantanément les résultats dans diverses conditions expérimentales. Contrairement aux méthodes conventionnelles, cette méthode ne nécessite pas de fixation, de coloration et de traitement d’échantillon pour analyser les cellules qui migrent ou envahissent. Ce document de méthode met l’accent sur les procédures détaillées pour la détermination en temps réel de la migration et l’invasion des cellules cancéreuses de glioblastome.
Introduction
Le cancer est une maladie mortelle en raison de sa capacité à métastaser à différents organes. La détermination des génotypes et des phénotypes du cancer est essentielle à la compréhension et à la conception de stratégies thérapeutiques efficaces. Des décennies de recherche sur le cancer ont mené au développement et à l’adaptation de différentes méthodes pour déterminer les génotypes et les phénotypes du cancer. L’un des derniers développements techniques est la mesure en temps réel de la migration cellulaire et l’invasion basée sur l’impédance cellulaire. L’adhérence cellulaire aux substrats et aux contacts cellulaires joue un rôle important dans la communication et la régulation des cellules à cellule, le développement et l’entretien des tissus. Les anomalies dans l’adhérence cellulaire conduisent à la perte de contact cellule-cellule, la dégradation de la matrice extracellulaire (ECM), et le gain des capacités migratrices et envahissantes par les cellules, qui contribuent tous à la métastase des cellules cancéreuses à différents organes1,2. Diverses méthodes sont disponibles pour déterminer la migration cellulaire (cicatrisation des plaies et les essais de chambre Boyden) et l’invasion (Matrigel-Boyden chamber assay)3,4,5. Ces méthodes conventionnelles sont semi-quantitatives parce que les cellules doivent être étiquetées avec un colorant fluorescent ou d’autres colorants avant ou après l’expérience pour mesurer les phénotypes cellulaires. En outre, des perturbations mécaniques sont nécessaires dans certains cas pour créer une plaie pour mesurer la migration des cellules vers le site de la plaie. En outre, ces méthodes existantes sont longues, à forte intensité de main-d’œuvre, et mesurent les résultats à un moment donné. En outre, ces méthodes sont sujettes à faire des mesures inexactes en raison de la manipulation incohérente au cours de la procédure expérimentale6.
Contrairement aux méthodes conventionnelles, le système d’analyse cellulaire en temps réel mesure l’impédance cellulaire en temps réel sans nécessiter de dommages pré- ou post-posts et mécaniques des cellules. Plus important encore, la durée d’une expérience peut être prolongée afin que les effets biologiques puissent être déterminés d’une manière dépendante du temps. L’exécution de l’expérience est efficace dans le temps et n’est pas exigeante en main-d’œuvre. L’analyse des données est relativement simple et précise. Par rapport à d’autres méthodes, cette méthode est l’une des meilleures mesures en temps réel pour mesurer la migration cellulaire et l’invasion6,7,8,9.
Giaever et Keese ont été les premiers à décrire la mesure basée sur l’impedance d’une population cellulaire à la surface des électrodes10. Le système d’analyse cellulaire en temps réel fonctionne sur le même principe. La superficie de chaque puits de microplaque est couverte à environ 80 % d’une gamme de microélectrtrodes en or. Lorsque la surface de l’électrode est occupée par des cellules en raison de l’adhérence ou de la propagation des cellules, l’obstacle électrique change. Cet obstacle est affiché comme l’indice cellulaire, qui est directement proportionnel aux cellules couvrant la surface de l’électrode après qu’ils pénètrent dans la membrane microporous (la taille médiane de pores de cette membrane est de 8 m)11.
Crk et CrkL sont des protéines adaptatrices contenant des domaines SH2 et SH3 et jouent des rôles importants dans diverses fonctions cellulaires, telles que la régulation du cytosquelette, la transformation cellulaire, la prolifération, l’adhérence, la transition épithéliale-mésenchymale, la migration, l’invasion et la métastase en médiateur des interactions protéines-protéines dans de nombreuses voies de signalisation1,12,13,14,15,16 ,16, 17, 18. Par conséquent, il est important de déterminer les capacités migratrices et invasives dépendantes de Crk/CrkL des cellules cancéreuses. L’analyse de cellules en temps réel a été effectuée pour déterminer les capacités migratrices et invasives des cellules de glioblastoma sur le knockdown de gène de Crk et de CrkL.
Ce document de méthode décrit des mesures détaillées de la migration et de l’invasion de cellules de glioblastome humain.
Protocol
Representative Results
Discussion
La mesure en temps réel de la migration cellulaire et de l’invasion à l’aide du système d’analyse cellulaire en temps réel est un processus de surveillance simple, rapide et continu avec des avantages multiples et significatifs par rapport aux méthodes traditionnelles qui fournissent des données à un moment donné. Comme pour les méthodes traditionnelles, les conditions expérimentales doivent être optimisées pour chaque lignée cellulaire pour le système d’analyse cellulaire en temps réel, car chaque…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Olivia Funk pour son assistance technique aux données du système d’analyse cellulaire en temps réel. Nous remercions également le Medical Writing Center de Children’s Mercy Kansas City d’avoir édité ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par Tom Keaveny Endowed Fund for Pediatric Cancer Research (à TP) et par children’s Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Advisory Council funding (to TP).
Materials
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | Co2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
References
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