がん細胞の移動と浸潤のインピーダンスベースリアルタイム測定
Summary
癌は、異なる器官に転移する能力のために致死的な病気である。様々な治療条件下で癌細胞が移行し、侵入する能力を決定することは、治療戦略を評価する上で極めて重要である。このプロトコルは、神経膠芽腫癌細胞株のリアルタイム転移能力を評価する方法を提示する。
Abstract
癌は、遺伝的不安定性、突然変異、および環境および他のストレス要因によって開始された細胞の制御されていない増殖のために生じる。これらの獲得した、複雑な多層分子シグナル伝達ネットワークの異常は、異常な細胞増殖と生存、細胞外マトリックス分解、および遠くの器官への転移を誘発する。癌関連死の約90%は、転移性播種の直接的または間接的な影響によって引き起こされると推定される。そのため、遺伝的・環境的操作を行う際に、がん細胞の挙動を特徴づけるための、信頼性の高い総合的なシステムを確立することが重要です。このようなシステムは、癌転移の分子調節と階層化された、正確な治療戦略の開発を成功させる機会を明確に理解することができる。したがって、遺伝子の機能の利得または喪失を伴う移動や侵入などの癌細胞行動の正確な決定は、癌細胞の積極的な性質の評価を可能にする。細胞インピーダンスに基づくリアルタイム測定システムにより、実験全体で継続的にデータを取得し、様々な実験条件下で結果を即座に比較して定量化することができます。従来の方法とは異なり、この方法は、移動または侵入する細胞を分析するために固定、染色、およびサンプル処理を必要としません。本論文では、神経膠芽腫癌細胞の移動と浸潤をリアルタイムに決定するための詳細な手順を強調する。
Introduction
癌は、異なる器官に転移する能力のために致死的な病気である。がん遺伝子型と遺伝子型の決定は、効果的な治療戦略を理解し、設計する上で重要です。数十年にわたるがん研究は、がん遺伝子型と型を決定するさまざまな方法の開発と適応につながっています。最新の技術開発の1つは、細胞インピーダンスに基づく細胞移動と浸潤のリアルタイム測定です。細胞接着は、細胞間通信および組織の調節、開発、維持において重要な役割を果たす。細胞接着の異常は、細胞間接触の喪失、細胞外マトリックス(ECM)の分解、および細胞による遊走および侵入能力の利益を招き、そのすべてが異なる器官11、22に癌細胞の転移に寄与する。細胞の移動(創傷治癒およびボイデンチャンバーアッセイ)および侵略(マトリゲルボイデンチャンバーアッセイ)3、4、54,5を決定するために様々な方法が利用可能である。3これらの従来の方法は、細胞の細胞のタイプを測定する実験の前後に蛍光色素または他の色素で標識する必要があるため、半定量的である。さらに、創傷部位への細胞の移動を測定するための創傷を作成するために機械的破壊が必要な場合がある。さらに、これらの既存の方法は時間がかかり、労力を要し、結果を一度に測定するだけです。さらに、これらの方法は、実験手順6の間に一貫性のない処理のために不正確な測定を行う傾向がある。
従来の方法とは異なり、リアルタイムの細胞分析システムは、細胞のプレステインやポストステイン、機械的損傷を必要とせずに、リアルタイムで細胞インピーダンスを測定します。さらに重要なことは、実験の持続時間を延長して、時間依存的な方法で生物学的効果を決定できることである。実験の実行は時間効率が良く、労働集約的ではありません。データの分析は比較的簡単で正確です。他の方法と比較して、この方法は、細胞の移動と浸潤66、7、8、97,8,9を測定するための最良のリアルタイム測定の1つです。
GiaeverとKeeseは電極10の表面上の細胞集団のインピーダンスベースの測定を最初に記述した。リアルタイムセル解析システムは同じ原理で動作します。各マイクロプレートウェルの面積は、金のマイクロ電極の配列で覆われて約80%です。電極表面積が細胞の付着または広がりによる細胞によって占拠されると、電気インピーダンスが変化する。このインピーダンスは、細胞指数として表示され、これは、微多孔膜に浸透した後の電極表面積を覆う細胞に直接比例する(この膜の中央の細孔サイズは8μmである)11。
CrkおよびCrkLはSH2およびSH3ドメインを含むアダプタタンパク質であり、細胞骨格調節、細胞変容、増殖、接着、上皮間葉移行、移行、侵入、転移などの様々な細胞機能において重要な役割を果たす。1,12,13,14,15,16,17, 18.したがって、がん細胞のCrk/CrkL依存性の移動能力と侵襲性能力を決定することが重要です。リアルタイム細胞解析を行い、CrkおよびCrkLの遺伝子ノックダウン時の神経膠芽腫細胞の回遊性および侵襲能力を決定した。
本論文では、ヒト神経膠芽腫細胞のCrk-およびCrkL媒介性移動および浸潤の詳細な測定について述べている。
Protocol
Representative Results
Discussion
リアルタイムセル解析システムを使用した細胞移動と浸潤のリアルタイム測定は、単一のタイムポイントでデータを提供する従来の方法よりも、複数の重要な利点を持つ、シンプルで迅速かつ継続的なモニタリングプロセスです。従来の方法と同様に、実験条件は、リアルタイム細胞分析システムの各細胞株に対して最適化する必要があります。侵略的な能力。これらの違いにより、各細胞?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
リアルタイムの細胞解析システムデータに関する彼女の技術支援に対して、オリビア・ファンクに感謝します。また、この原稿を編集してくれたチルドレンズ・マーシー・カンザスシティのメディカル・ライティング・センターにも感謝します。この研究は、トム・キーヴェニー小児がん研究基金(TP)と小児慈悲病院中西部がんアライアンスパートナー諮問委員会(TPへの資金提供)によって支援されました。
Materials
| Biosafety cabinet | ThermoFisher Scientific | 1300 Series Class II, Type A2 | |
| CIM plates | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk siRNA | Dharmacon | J-010503-10 | |
| CrkL siRNA | Ambion | ID: 3522 and ID: 3524 | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Culture medium used for cell culture |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21-031-CV | DPBS used to wash the cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | ThermoFisher Scientific | 51030285 | Co2 incubator |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | Extracellular matrix gel |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | D-001810-01 | siRNA for non targated control |
| Odyssey CLx (Imaging system) | LI-COR Biosciences | Western blot imaging system | |
| RTCA software | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | Instrument used for experiment | |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| U-118MG | ATCC | ATCC HTB15 | Cell lines used for experiments |
| xCELLigence RTCA DP | Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for experiment |
References
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Mudduluru, G., et al. Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer. Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).
- Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer. Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).
- Khalili, A. A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion. Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).
- Scrace, S., O’Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions. Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).
- Kumar, S., et al. Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).
- Collins, T. N., et al. Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation. Elife. 7, (2018).
- Fathers, K. E., et al. Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis. Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).
- Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras. Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).
- Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Rodrigues, S. P., et al. CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells. Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice. Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Hallock, P. T., et al. Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L. Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).
