Protokollen beskriver innstillingene og bruken av en kapillær aerosolgenerator for kontinuerlig produksjon av kontrollert aerosol fra en multispesifikk væskeløsning, egnet for jevn aerosollevering i stort volum (f.eks. in vivo-innåndingsstudier).
Den kapillære aerosolgeneratoren (CAG) drives med hovedstolen for termisk væskefordampning gjennom oppvarming av e-væske i startfasen, etterfulgt av kjernedannelse og kondens regulert gjennom en blanding av luftstrøm for å generere aerosoler, for eksempel i en elektronisk sigarett (EC). CAG er spesielt nyttig for å generere aerosoler av store volumer på en kontinuerlig måte, for eksempel in vivo inhalasjonstoksikologistudier, hvor bruk av ECs ikke er mulig. De termiske effektene av å generere aerosol fra CAG er like når det gjelder temperatur som brukes i en EC, og tillater dermed etterforskere å vurdere damper av e-væsker i skala og reproduserbarhet. Ettersom driften av CAG tillater brukere å kontrollere kritiske parametere som strømningshastigheten til e-væske, oppvarmingstemperaturer og fortynningsluftstrømmer, tillater det etterforskere å teste ulike e-væskeformuleringer i en godt kontrollert enhet. Egenskaper, som aerosolpartikkelstørrelse, er vist å være regulert med luftstrømningshastigheten med hensyn til e-væskestrømmen og e-væskesammensetningen. Cag er imidlertid begrenset i vurderingen av vanlige EC-relaterte problemer, for eksempel overoppheting av elementene. Vi søker å demonstrere at CAG kan generere aerosol som er reproduserbar og kontinuerlig, ved å vurdere de kjemiske og fysiske aerosolegenskapene med en valgt e-væskeformulering. Protokollen beskriver driftsparametrene for væskestrømningshastighet, fortynning av luftstrømshastigheter og driftsprosedyrer som trenger å optimalisere aerosolkonsentrasjonen og partikkelstørrelsen som kreves for en in vivotoksikologistudie . Ved å presentere de representative resultatene fra protokollen og diskutere utfordringene og anvendelsene ved å jobbe med en CAG, viser vi at CAG kan brukes på en reproduserbar måte. Teknologien og protokollen, som er utviklet fra tidligere arbeid, tjener som grunnlag for fremtidige innovasjoner for laboratoriekontrollerte aerosolgenereringsundersøkelser.
Vanlige e-væsker inneholder en blanding av propylenglykol, glyserol, vann, nikotin og utvalgte smaker. Sammensetningen av en aerosol generert fra en EC-enhet avhenger ikke bare av væskeformuleringen, men også på materialet, designen og egenskapene til enheten. Følgelig kan mange EC-enheter introdusere en stor variasjon i aerosolutgang1, inkludert enhetsspesifikk produksjon av forhøyede nivåer av uønskede bestanddeler, variasjon av puffvolum, endring i luftstrømmen på grunn av blokkerte ventilasjonshull og “tørr puffing” (når væskebeholderen er nesten tom, forårsaker overoppheting av enheten fordi en del av den leverte energien ikke brukes til væskefordampning)2 . I tillegg vil lading, påfylling og rengjøring av EC-enheter under langsiktige innåndingsstudier bli en stor tilleggsbegrensning når det gjelder logistikk3. Av disse grunnene bør andre aerosolgeneratorer vurderes for storskala produksjon av aerosoler og riktig evaluering av flytende formuleringer, samtidig som de unngår enhetsrelaterte variasjoner i aerosolsammensetning og reduserer arbeidsbelastningen 4,5. Likevel bør enhetsgenererte aerosoler forbli en del av risikovurderingsstrategier, fordi nivåene av visse bestanddeler i EC-enheter kan være mer forhøyet enn de i laboratoriekontrollerte standardiserte aerosolgeneratorer på grunn av oppvarmings- / kjølespesifikasjonene til enhetene 6,7,8.
På grunn av den begrensede informasjonen om regulatoriske krav som for tiden er tilgjengelige, utvikler evalueringsmetoder for potensiell toksisitet av aerosoler generert av elektroniske sigaretter (EC) fortsatt 9,10,11. Imidlertid krever nøyaktig in vitro– og in vivo-evaluering generering av godt karakteriserte og reproduserbare mengder aerosol over tid. Å produsere aerosol fra en EC-enhet med et kontrollert pufferegime vil absolutt være den mest representative prosessen fra brukerforbrukets perspektiv. For regulatoriske toksisitetsstudier, med tanke på en rekke mulige væskeformuleringer som brukere ofte kan forberede av seg selv og samtidig endre noen enhetskarakteristikker (f.eks. levert energi), er bruk av EC-enheter for å utføre langsiktige toksikologistudier med gjentatt eksponering ikke bare utfordrende, men også potensielt utilstrekkelig.
Den kapillære aerosolgeneratoren (CAG)-utviklet av Philip Morris12,13 og videreutviklet av Virginia Commonwealth University14-arbeider på prinsippet om å skape en stråle med varm dampstrøm fra en elektrisk oppvarmet kapillær, som senere avkjøles med omgivelsesluft, forårsaker partikkelkjernedannelse og etterfølgende kondens, noe som fører til aerosoldannelse. Fordi de samme fysiske prosessene fører til aerosoldannelse i ECs (bortsett fra levering av væsken til kapillæren av en pumpe i CAG, som i en EC vanligvis erstattes av kapillære krefter som virker på det fukttransporterende materialet som trekker væsken fra reservoaret i EC), er egenskapene til CAG-genererte aerosoler svært lik de av EC aerosoler14 (figur 14 (figur 1 ). CAG tillater produksjon av store mengder aerosol, med få håndteringskrav; Det er derfor spesielt egnet for in vivo inhalasjonsstudier.
CAG er en laboratorieenhet som består av et oppvarmet kapillærrør som bare er koblet til en temperaturregulator og til et flytende reservoar via en peristaltisk pumpe (figur 2A). Kapillæren (160 mm, 21 G, rustfritt stål) varmes opp av fire varmeelementer, alle innebygd i en aluminiumsblokk (figur 2B). Temperaturen er vanligvis satt til 250-275 °C for å etterligne spoleoppvarmingsforholdene til en EC-enhet15. Væsken pumpet gjennom kapillæren oppvarmes og omdannes til varm damp som går ut av spissen av kapillæren. CAG-enheten (figur 2C) krever flere elementer for å blande den genererte dampen med kald luft og danne en aerosol. Den brå blandingen av den varme overmettet dampen med en kald luftstrøm resulterer i kjernedannelse og påfølgende kondens, noe som fører til aerosoldannelse (figur 2C). I cag-designen vår (figur 3) kjøler en ekstra oppvarmet luftstrøm først ned den ytre kroppen og sirkulerer deretter langs varmeblokkene for å varme opp luftstrømmen, og forhindrer samtidig kondens av væsketilstrømningen på spissen av kapillæren og stabilisere dampstrålen brister. I tillegg skaper det uønsket skjerming av varme damper, og påvirker dermed nukleasjonsprosessen. Av denne grunn bør strømningshastigheten som brukes for denne luftstrømmen være minimal og passe formålet med applikasjonen. Denne luftstrømmen vil bli kalt “oppvarmet luftstrøm” gjennom dette manuskriptet, selv om det må forstås at denne strømmen oppvarmes passivt av varmeblokkene og ikke med vilje av brukeren.
Kjøleluftstrømmen har en sterk innvirkning på størrelsen på de genererte aerosolpartiklene. I aerosolproduksjon for in vivo-innåndingsstudier vil fortynningsluftstrømmen bestemme eksponeringsdosen og må kanskje fortynnes ytterligere før eksponeringskammeret når. Foruten den kjemiske sammensetningen av aerosoler, er det viktig å karakterisere aerosolpartikkelstørrelsesfordeling (PSD) for å sikre at den genererte aerosolen ligner den som genereres av ECs og innenfor innåndingspartikkelstørrelsesområdet anbefalt av OECDs retningslinjer (ofte parameterisert ved antagelsen om log-normalitet av PSD med massemedian aerodynamisk diameter [MMAD] og geometrisk standardavvik [GSD]).
MMAD av de genererte aerosolene kan variere mye avhengig av enhetens design, fysisk-kjemiske flytende egenskaper av formuleringen (f.eks. tetthet, viskositet og overflatespenning), luftstrømningshastighet og temperaturdikterende termodynamiske forhold 14,16,17. For in vivoeksponeringsforsøk består luftstrømmen vanligvis av kondisjonert, filtrert luft ved 22 ± 2 °C og 60 % ± 5 % relativ fuktighet. Den genererte aerosolen kan deretter fortynnes ytterligere avhengig av studiekravene, for å oppnå målkonsentrasjoner i testatmosfæren. Den leveres deretter via glassrør til eksponeringskammeret for å redusere filtreringstapet. I resultatene som presenteres her, etableres temperatur- og luftstrømsinnstillingene for å demonstrere at CAG kan brukes til kontinuerlig produksjon av en kontrollert aerosol med konsistent og inhalerbar PSD og definerte konsentrasjoner for in vivo inhalasjonsstudier.
I protokollen vil vi beskrive hvordan: 1) montere CAG, 2) bestemme parametere som kreves for å generere aerosol fra CAG, 3) utføre aerosolgenerering, og 4) analysere fysiske og kjemiske bestanddeler av interesse for aerosolen. For disse foreløpige løpene vurderer vi en flytende løsning basert på en blanding av aerosoldannende komponenter: propylenglykol (PG), glyserol (VG), vann og nikotin ved foreskrevne massefraksjoner. Til slutt vil vi dele eksempeldata for vurdering av en kompleks multiartblanding generert i våre eksperimenter (som involverer de ovennevnte bestanddelene blandet med ekstra smaksbestanddeler). Vi vil diskutere de samlede resultatene og utfordringene sammen med anvendelsen av denne eksperimentelle tilnærmingen for vurdering av slike blandinger.
Generering av aerosoler med CAG bidrar til å redusere variasjonen av EC-enhetsspesifikke aerosoliseringsprosesser, noe som muliggjør objektiv og kontrollerbar vurdering av selve den aerosoliserte e-væskeformuleringen. CAG-genererte aerosoler har vist seg å være representative for aerosolene som genereres av ECs7. De kan reproduseres med samme sammensetning og egenskaper og er derfor spesielt egnet for in vivo langsiktige eksponeringsstudier som krever store mengder aerosol over lang tid8.
CAG-oppsettet er relativt enkelt å montere og enkelt å vedlikeholde. Imidlertid er driftsparametrene, for eksempel væskestrømningshastighet og respektive luftstrømningshastigheter fortsatt kritiske for produksjon av kontrollert aerosol, noe som krever metodeoptimalisering i henhold til formålet med anvendelsen av den CAG-genererte aerosolen.
Resultatene som presenteres i den nåværende studien viser at kjøleluftstrømmen har en klar effekt på aerosolpartikkelstørrelsesfordelingen. Kjøleluftstrømmen har en direkte innvirkning ikke bare på kjernen av de genererte dampene, men også på kondens, på grunn av kjøling av de indre slangene der den genererte aerosolen strømmer. I tillegg er den tette aerosolen utsatt for betydelige koagulasjonseffekter. Kombinert er disse prosessene komplekse, og deres interaksjon og innflytelse på aerosoldannelse er ganske vanskelig å generalisere for de spesifikke e-væsker, temperaturer og strømmer. Ekstra luftstrømssammensetning (tørr eller fuktet med en fast prosentandel relativ fuktighet) – spesielt vanninnhold – vil påvirke varme- og masseutveksling, noe som ikke bare fører til modulert kondensvekst av aerosolpartikler, men også veggkondensasjon. Dermed anses modifikasjoner av denne metodens parametere for bruk når det gjelder å kontrollere PSD17,19.
Tilstedeværelsen av kjemikalier med lav løselighet eller høye kokepunkter kan begrense effektiviteten av CAG-generert aerosol på grunn av nedbør i kapillæren og tilstoppingen av kapillæren over tid. Avhengig av kjemikaliene som er tilstede i aerosolen, må temperaturen for drift av CAG justeres for å generere dampen. I tillegg bør stabiliteten til væskeformuleringen vurderes regelmessig. Tilsetning av bestanddeler, inkludert smaker, med forskjellige kokepunkter vil ha innflytelse på den endelige aerosolsammensetningen14 og gass-væskepartisjonering. Det kan være nødvendig å tilpasse den kapillære temperaturen og varmeluftstrømmen for å forhindre tilbakestrømning og væskeavsetning nær den varme kapillæren, noe som kan føre til generering av ukontrollerte produkter av termisk nedbrytning (for eksempel karbonyler) på grunn av den lange varigheten av oppbevaring av væsken ved høy temperatur. I tillegg har kontroll av temperaturen som brukes til å generere dampen i kapillæren en innvirkning på hvor dampen begynner å danne seg i kapillæren – jo høyere temperaturen er, jo tidligere dannes dampen. Med en høyere kapillærtemperatur vil dampen som kommer ut av kapillæren ta lengre tid å bli avkjølt av kjøleluftstrømmen, og vil derfor begynne å nukleere og kondensere inn i en aerosol lenger unna kapillærspissen, noe som bidrar til å unngå en tilbakestrømningseffekt19.
Nåværende e-væske in vivo toksikologi studier er begrenset i å reprodusere e-sigarett aerosoler på grunn av logistisk kompleksitet for å møte omfanget av aerosol som kreves, for eksempel i en OECD TG 413 studie20. Protokollen som presenteres i denne studien gir en oversikt over CAG-monteringen og innstillingene som brukes ved Philip Morris International for aerosolgenerering i in vivo langtidseksponeringsstudier18. Disse dataene kan være et godt utgangspunkt for videre finjustering i et annet laboratoriemiljø (f.eks. systemer for legemiddellevering21) eller for tilpasning til spesifikke krav i en bestemt studie.
The authors have nothing to disclose.
Aluminium front cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
Aluminium heating block, groove diameter 0.4mm | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | B-505432 | 2 x |
Aluminium rear cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
Cambridge glass filter pads | GE Healthcare UK Limited | 9703-9654 | 44 mm diameter |
Capillary 21 G SS, 160 mm | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | 304H21RW | 1 x |
Dry wipes | Contec Inc. , SC, USA | Prosat Wipes saturated with isopropyl alcohol | cleaning material |
Flowmeter | TSI, Shoreview, MI, USA | 4100 Series, 0-20 L/min | or equivalent |
Gilibrator-2 calibrator | Sensidyne, St-Petersburg FL, USA | Gilian Gilibrator-2 | Air flow calibrator |
Glass Couplings | Labo Service, Kontich, Belgium | QVF | |
Glass piping | Labo Service, Kontich, Belgium | QVF | Pipe 25 and 40 mm |
Heating elements | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | LDC01864 | 4 x |
High heat grease | Lubriplate Lubricant Company, NJ, USA | High temperature multipurpose grease | CAG maintenance |
Inner PEEK tube | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
Magnetic stirrer | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Germany | C-MAG HS 4 | or equivalent |
Micro impingers | Labo Service, Kontich, Belgium | Custom Built | |
Outer SS tube | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
PEEK adaptor | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
Peristaltic pump | Watson-Marlow Fluid Technology Group, Falmouth, UK | Watson-Marlow 530 U | or equivalent |
Push-in fitting | Festo Pte Ltd | NPQM-DK-M5-Q4-P10 | 1 x |
Sample Column Extrelut NT3 cartridge | Merk Sigma-Aldrich | 115095 | |
SS 25 mm assembly cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
SS M8 lead screw | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 3 x |
SS M8 nut | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 3 x |
SS rear backing | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
Temperature controller | Cole Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Digi-Sense TC 9600 | or equivalent |
Thermocouple type K | RS Components GmbH, Wädenswil, Switzerland | 814-0147 | 1 x |