Das Protokoll beschreibt die Einstellungen und die Verwendung eines Kapillaraerosolgenerators für die kontinuierliche Produktion von kontrolliertem Aerosol aus einer flüssigen Lösung mit mehreren Spezies, die für die stetige großvolumige Aerosolabgabe (z. B. In-vivo-Inhalationsstudien ) geeignet ist.
Der Kapillaraerosolgenerator (CAG) wird mit dem Prinzip der thermischen Flüssigkeitsverdampfung durch Erwärmung von E-Liquid in der Anfangsphase betrieben, gefolgt von Keimbildung und Kondensation, die durch ein Gemisch aus Luftstrom reguliert werden, um Aerosole zu erzeugen, wie z.B. in einer elektronischen Zigarette (EC). Das CAG ist besonders nützlich bei der kontinuierlichen Erzeugung von Aerosolen großer Volumina, z. B. bei In-vivo-Inhalationstoxikologiestudien , bei denen die Verwendung von ECs nicht möglich ist. Die thermischen Auswirkungen der Erzeugung von Aerosol aus dem CAG sind in Bezug auf die in einer EC angewendete Temperatur ähnlich, so dass die Forscher die Dämpfe von E-Liquids in großem Maßstab und Reproduzierbarkeit beurteilen können. Da der Betrieb des CAG es den Benutzern ermöglicht, kritische Parameter wie die Durchflussrate von E-Liquid, Heiztemperaturen und Verdünnungsluftströme zu steuern, können Forscher verschiedene E-Liquid-Formulierungen in einem gut kontrollierten Gerät testen. Es wird gezeigt, dass Eigenschaften, wie die Größe der Aerosolpartikel, mit dem Luftdurchsatz in Bezug auf den E-Liquid-Durchfluss und die E-Liquid-Zusammensetzung reguliert werden. Die CAG ist jedoch bei der Bewertung allgemeiner EG-bezogener Fragen, wie z. B. der Überhitzung ihrer Elemente, begrenzt. Wir wollen zeigen, dass das CAG Aerosol erzeugen kann, das reproduzierbar und kontinuierlich ist, indem wir die chemischen und physikalischen Aerosoleigenschaften mit einer ausgewählten E-Liquid-Formulierung bewerten. Das Protokoll beschreibt die Betriebsparameter des Flüssigkeitsdurchflusses, der Verdünnungsluftdurchflussraten und der Betriebsverfahren, die zur Optimierung der Aerosolkonzentration und Partikelgröße erforderlich sind, die für eine in vivo toxikologische Studie erforderlich sind. Durch die Präsentation der repräsentativen Ergebnisse des Protokolls und die Diskussion der Herausforderungen und Anwendungen der Arbeit mit einem CAG zeigen wir, dass CAG reproduzierbar eingesetzt werden kann. Die Technologie und das Protokoll, die aus früheren Arbeiten entwickelt wurden, dienen als Grundlage für zukünftige Innovationen für laborgesteuerte Untersuchungen zur Aerosolerzeugung.
Gängige E-Liquids enthalten eine Mischung aus Propylenglykol, Glycerin, Wasser, Nikotin und ausgewählten Geschmacksrichtungen. Die Zusammensetzung eines von einem EC-Gerät erzeugten Aerosols hängt nicht nur von der flüssigen Formulierung ab, sondern auch vom Material, dem Design und den Eigenschaften des Geräts. Folglich können viele EG-Produkte eine große Variabilität der Aerosolabgabe1 verursachen, einschließlich der gerätespezifischen Erzeugung erhöhter Konzentrationen unerwünschter Bestandteile, der Variation des Puffvolumens, der Änderung des Luftstroms aufgrund blockierter Lüftungslöcher und des “trockenen Puffens” (wenn der Flüssigkeitsbehälter fast leer ist, was zu einer Überhitzung des Geräts führt, da ein Teil der gelieferten Energie nicht für die Flüssigkeitsverdampfung verwendet wird)2 . Darüber hinaus würde das Aufladen, Nachfüllen und Reinigen von EC-Geräten während langfristiger Inhalationsstudien zu einem enormen zusätzlichen Hindernis für die Logistikwerden 3. Aus diesen Gründen sollten andere Aerosolgeneratoren für die großtechnische Produktion von Aerosolen und die ordnungsgemäße Bewertung flüssiger Formulierungen in Betracht gezogen werden, wobei gerätebedingte Schwankungen der Aerosolzusammensetzung vermieden und die Arbeitsbelastung verringertwerden sollte 4,5. Dennoch sollten geräteerzeugte Aerosole Teil der Risikobewertungsstrategien bleiben, da die Konzentrationen bestimmter Bestandteile in EG-Produkten aufgrund der Heiz-/Kühlungsbesonderheiten der Produkte höher sein könntenals in laborgesteuerten standardisierten Aerosolgeneratoren 6,7,8.
Aufgrund der begrenzten Informationen über die derzeit verfügbaren regulatorischen Anforderungen entwickeln sich die Bewertungsmethoden für die potenzielle Toxizität von Aerosolen, die von elektronischen Zigaretten erzeugt werden, (EC) nochweiter 9,10,11. Eine genaue In-vitro- und In-vivo-Bewertung erfordert jedoch die Erzeugung gut charakterisierter und reproduzierbarer Aerosolvolumina im Laufe der Zeit. Die Herstellung von Aerosol aus einem EC-Gerät mit einem kontrollierten Puffregime wäre sicherlich der repräsentativste Prozess aus Sicht des Benutzerverbrauchs. Für Studien zur regulatorischen Toxizität, unter Berücksichtigung einer Vielzahl möglicher flüssiger Formulierungen, die Benutzer häufig selbst herstellen können, und gleichzeitig unter Änderung einiger Produkteigenschaften (z. B. gelieferte Energie) ist die Verwendung von EC-Produkten für die Durchführung von toxikologischen Langzeitstudien mit wiederholter Exposition nicht nur eine Herausforderung, sondern auch potenziell unzureichend.
Der Kapillaraerosolgenerator (CAG), der von Philip Morris 12,13 entwickelt und von der Virginia Commonwealth University14 weiterentwickelt wurde, arbeitet nach dem Prinzip, einen heißen Dampfstrahl aus einer elektrisch beheizten Kapillare zu erzeugen, der anschließend mit Umgebungsluft abgekühlt wird, was zur Bildung von Partikelkernen und anschließender Kondensation führt, was zur Aerosolbildung führt. Da die gleichen physikalischen Prozesse zur Aerosolbildung in ECs führen (abgesehen von der Abgabe der Flüssigkeit an die Kapillare durch eine Pumpe im CAG, die in einem EC üblicherweise durch Kapillarkräfte ersetzt wird, die auf das ableitende Material wirken, das die Flüssigkeit aus dem Reservoir in der EC zieht), sind die Eigenschaften von CAG-erzeugten Aerosolen denen von EC-Aerosolen14 sehr ähnlich (Abbildung 1 ). Das CAG ermöglicht die Produktion großer Aerosolmengen mit geringen Handhabungsanforderungen. Es eignet sich daher besonders für In-vivo-Inhalationsstudien.
Das CAG ist ein Laborgerät, das aus einem beheizten Kapillarrohr besteht, das einfach mit einem Temperaturregler und über eine Peristaltikpumpe mit einem Flüssigkeitsreservoir verbunden ist (Abbildung 2A). Die Kapillare (160 mm, 21 G, Edelstahl) wird durch vier Heizelemente beheizt, die alle in einen Aluminiumblock eingebettet sind (Abbildung 2B). Die Temperatur wird typischerweise auf 250-275 °C eingestellt, um die Spulenerwärmungsbedingungen eines EC-Geräts15 nachzuahmen. Die durch die Kapillare gepumpte Flüssigkeit wird erhitzt und in heißen Dampf umgewandelt, der aus der Spitze der Kapillare austritt. Die CAG-Baugruppe (Abbildung 2C) benötigt zusätzliche Elemente, um den erzeugten Dampf mit kalter Luft zu mischen und ein Aerosol zu bilden. Das abrupte Mischen des heißen, übersättigten Dampfes mit einem kalten Luftstrom führt zu Keimbildung und anschließender Kondensation, was zur Aerosolbildung führt (Abbildung 2C). In unserem CAG-Design (Abbildung 3) kühlt ein zusätzlicher beheizter Luftstrom zunächst den äußeren Körper ab und zirkuliert anschließend entlang der Heizblöcke, um den Luftstrom zu erwärmen, wodurch gleichzeitig die Kondensation des Flüssigkeitsrückstroms an der Spitze der Kapillare verhindert und der Dampfstrahlbruch stabilisiert wird. Darüber hinaus erzeugt es eine unerwünschte Abschirmung von heißen Dämpfen und beeinflusst so den Keimbildungsprozess. Aus diesem Grund sollte der für diesen Luftstrom angewendete Durchfluss minimal sein und dem Zweck der Anwendung entsprechen. Dieser Luftstrom wird in diesem Manuskript als “beheizter Luftstrom” bezeichnet, obwohl verstanden werden muss, dass dieser Strom passiv von den Heizblöcken und nicht absichtlich vom Benutzer erwärmt wird.
Der Kühlluftdurchsatz hat einen starken Einfluss auf die Größe der erzeugten Aerosolpartikel. Bei der Aerosolproduktion für In-vivo-Inhalationsstudien bestimmt der Verdünnungsluftstrom die Expositionsdosis und muss möglicherweise weiter verdünnt werden, bevor die Expositionskammer erreicht wird. Neben der chemischen Zusammensetzung von Aerosolen ist es wichtig, die Aerosolpartikelgrößenverteilung (PSD) zu charakterisieren, um sicherzustellen, dass das erzeugte Aerosol dem von ECs erzeugten Aerosol ähnelt und innerhalb des von den OECD-Leitsätzen empfohlenen Inhalationspartikelgrößenbereichs liegt (oft parametrisiert durch die Annahme der logarithmischen Normalität von PSD mit einem aerodynamischen Massendurchmesser [MMAD] und einer geometrischen Standardabweichung [GSD]).
Der MMAD der erzeugten Aerosole kann je nach Gerätedesign, physikalisch-chemischen Flüssigkeitseigenschaften der Formulierung (z. B. Dichte, Viskosität und Oberflächenspannung), Luftdurchsatz und Temperatur, die thermodynamische Bedingungen diktiert14,16,17 stark variieren. Bei In-vivo-Expositionsexperimenten besteht der Luftstrom im Allgemeinen aus konditionierter, gefilterter Luft bei 22 ± 2 °C und 60 % ± 5 % relativer Luftfeuchtigkeit. Das erzeugte Aerosol kann dann je nach Studienbedarf weiter verdünnt werden, um Zielkonzentrationen in der Testatmosphäre zu erreichen. Es wird dann über Glasrohrleitungen in die Belichtungskammer geliefert, um den Filtrationsverlust zu verringern. In den hier vorgestellten Ergebnissen werden die Temperatur- und Luftstromeinstellungen festgelegt, um zu zeigen, dass das CAG für die kontinuierliche Produktion eines kontrollierten Aerosols mit konsistenter und inhalierbarer PSD und definierten Konzentrationen für In-vivo-Inhalationsstudien verwendet werden kann.
Im Protokoll beschreiben wir, wie man: 1) das CAG zusammenstellt, 2) Parameter bestimmt, die zur Erzeugung von Aerosol aus dem CAG erforderlich sind, 3) Aerosolerzeugung durchführt und 4) physikalische und chemische Bestandteile analysiert, die im Aerosol von Interesse sind. Für diese Vorläufe betrachten wir eine flüssige Lösung, die auf einer Mischung von aerosolbildenden Komponenten basiert: Propylenglykol (PG), Glycerin (VG), Wasser und Nikotin in vorgeschriebenen Massenanteilen. Schließlich werden wir Beispieldaten für die Bewertung einer komplexen Multispezies-Mischung teilen, die in unseren Experimenten erzeugt wurde (einschließlich der oben genannten Bestandteile, die mit zusätzlichen Geschmacksbestandteilen gemischt werden). Wir werden die Gesamtergebnisse und Herausforderungen sowie die Anwendbarkeit dieses experimentellen Ansatzes für die Bewertung solcher Mischungen diskutieren.
Die Erzeugung von Aerosolen mit CAG trägt dazu bei, die Variabilität von EC-Geräte-spezifischen Aerosolisierungsprozessen zu reduzieren, was eine objektive und kontrollierbare Bewertung der aerosolisierten E-Liquid-Formulierung selbst ermöglicht. Es hat sich gezeigt, dass CAG-erzeugte Aerosole repräsentativ für die von ECs7 erzeugten Aerosole sind. Sie können reproduzierbar mit der gleichen Zusammensetzung und den gleichen Eigenschaften erzeugt werden und eignen sich daher besonders für in vivo Langzeitexpositionsstudien, die große Mengen an Aerosol über einen langen Zeitraum erfordern8.
Das CAG-Setup ist relativ einfach zu montieren und einfach zu warten. Die Betriebsparameter wie der Flüssigkeitsdurchsatz und die jeweiligen Luftdurchflussraten bleiben jedoch für die Herstellung von kontrolliertem Aerosol kritisch, was eine Methodenoptimierung entsprechend dem Zweck der Anwendung des CAG-erzeugten Aerosols erfordert.
Die in der aktuellen Studie vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass der Kühlluftdurchsatz einen deutlichen Einfluss auf die Größenverteilung von Aerosolpartikeln hat. Der Kühlluftstrom hat einen direkten Einfluss nicht nur auf die Keimbildung der erzeugten Dämpfe, sondern auch auf die Kondensation, da der Innenschlauch, in den das erzeugte Aerosol fließt, abgekühlt wird. Darüber hinaus ist das dichte Aerosol anfällig für erhebliche Gerinnungseffekte. Zusammengenommen sind diese Prozesse komplex und ihre Wechselwirkung und ihr Einfluss auf die Aerosolbildung sind für die spezifischen E-Flüssigkeiten, Temperaturen und Strömungen eher schwer zu verallgemeinern. Die zusätzliche Zusammensetzung des Luftstroms (trocken oder mit einem festen Prozentsatz relativer Luftfeuchtigkeit befeuchtet) – insbesondere der Wassergehalt – beeinflusst Wärme und Massenaustausch, was nicht nur zu einem modulierten Kondensationswachstum von Aerosolpartikeln, sondern auch zu Wandkondensation führt. Daher gelten Änderungen an den Parametern dieser Methode als Verwendungszweck in Bezug auf die Kontrolle der PSD17,19.
Das Vorhandensein von Chemikalien mit geringer Löslichkeit oder hohen Siedepunkten könnte die Wirksamkeit von CAG-erzeugtem Aerosol aufgrund von Ausfällungen innerhalb der Kapillare und Verstopfung der Kapillare im Laufe der Zeit einschränken. Abhängig von den im Aerosol vorhandenen Chemikalien muss die Temperatur für den Betrieb des CAG angepasst werden, um den Dampf zu erzeugen. Darüber hinaus sollte die Stabilität der flüssigen Formulierung regelmäßig bewertet werden. Die Zugabe von Bestandteilen, einschließlich Aromen, mit unterschiedlichen Siedepunkten hat einen Einfluss auf die endgültige Aerosolzusammensetzung14 und die Gas-Flüssig-Partitionierung. Es kann notwendig sein, die Kapillartemperatur und den Wärmeluftstrom anzupassen, um einen Rückfluss und eine Ablagerung von Flüssigkeiten in der Nähe der heißen Kapillare zu verhindern, was aufgrund der langen Dauer der Retention der Flüssigkeit bei einer hohen Temperatur zur Erzeugung unkontrollierter Produkte des thermischen Abbaus (z. B. Carbonyle) führen könnte. Darüber hinaus hat die Kontrolle der Temperatur, die zur Erzeugung des Dampfes in der Kapillare verwendet wird, einen Einfluss darauf, wo sich der Dampf in der Kapillare zu bilden beginnt – je höher die Temperatur, desto früher wird der Dampf gebildet. Bei einer höheren Kapillartemperatur dauert es länger, bis der aus der Kapillare austretende Dampf durch den Kühlluftstrom abgekühlt wird, und beginnt daher, sich zu keimen und zu einem Aerosol zu kondensieren, das weiter von der Kapillarspitze entfernt ist, wodurch ein Rückflusseffekt vermiedenwird 19.
Aktuelle e-Liquid-In-vivo-Toxikologiestudien sind bei der Reproduktion von E-Zigaretten-Aerosolen aufgrund der logistischen Komplexität, um die erforderliche Aerosolskala zu erfüllen, begrenzt, wie in einer OECD TG 413-Studie20. Das in dieser Studie vorgestellte Protokoll gibt einen Überblick über den CAG-Aufbau und die Einstellungen, die bei Philip Morris International für die Aerosolerzeugung in in vivo-Langzeitexpositionsstudien verwendet werden18. Diese Daten können als guter Ausgangspunkt für die weitere Feinabstimmung in einer anderen Laborumgebung (z. B. Drug-Delivery-Systeme21) oder für die Anpassung an spezifische Anforderungen einer bestimmten Studie dienen.
The authors have nothing to disclose.
Aluminium front cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
Aluminium heating block, groove diameter 0.4mm | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | B-505432 | 2 x |
Aluminium rear cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
Cambridge glass filter pads | GE Healthcare UK Limited | 9703-9654 | 44 mm diameter |
Capillary 21 G SS, 160 mm | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | 304H21RW | 1 x |
Dry wipes | Contec Inc. , SC, USA | Prosat Wipes saturated with isopropyl alcohol | cleaning material |
Flowmeter | TSI, Shoreview, MI, USA | 4100 Series, 0-20 L/min | or equivalent |
Gilibrator-2 calibrator | Sensidyne, St-Petersburg FL, USA | Gilian Gilibrator-2 | Air flow calibrator |
Glass Couplings | Labo Service, Kontich, Belgium | QVF | |
Glass piping | Labo Service, Kontich, Belgium | QVF | Pipe 25 and 40 mm |
Heating elements | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | LDC01864 | 4 x |
High heat grease | Lubriplate Lubricant Company, NJ, USA | High temperature multipurpose grease | CAG maintenance |
Inner PEEK tube | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
Magnetic stirrer | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Germany | C-MAG HS 4 | or equivalent |
Micro impingers | Labo Service, Kontich, Belgium | Custom Built | |
Outer SS tube | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
PEEK adaptor | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
Peristaltic pump | Watson-Marlow Fluid Technology Group, Falmouth, UK | Watson-Marlow 530 U | or equivalent |
Push-in fitting | Festo Pte Ltd | NPQM-DK-M5-Q4-P10 | 1 x |
Sample Column Extrelut NT3 cartridge | Merk Sigma-Aldrich | 115095 | |
SS 25 mm assembly cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
SS M8 lead screw | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 3 x |
SS M8 nut | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 3 x |
SS rear backing | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
Temperature controller | Cole Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Digi-Sense TC 9600 | or equivalent |
Thermocouple type K | RS Components GmbH, Wädenswil, Switzerland | 814-0147 | 1 x |