Messung der RAN-Peptidtoxizität in C. elegans
Summary
Wiederholte nicht-ATG-abhängige Translationsprodukte sind neu entstehende pathogene Merkmale mehrerer wiederholter, auf Expansionskrankheiten basierender Krankheiten. Das Ziel des beschriebenen Protokolls ist es, die Toxizität zu bewerten, die durch diese Peptide verursacht wird, indem Verhaltens- und Zellassays im Modellsystem C. elegansverwendet werden.
Abstract
C. elegans wird häufig verwendet, um altersbedingte neurodegenerative Erkrankungen zu modellieren, die durch wiederholte Expansionsmutationen verursacht werden, wie Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und Huntington-Krankheit. Kürzlich wurde gezeigt, dass wiederholte, erweiterungshaltige RNA das Substrat für eine neuartige Art von Proteinübersetzung ist, die als repeat-assoziierte nicht-AUG-abhängige (RAN) Translation bezeichnet wird. Im Gegensatz zur kanonischen Übersetzung erfordert die RAN-Übersetzung kein Start-Codon und tritt nur auf, wenn Wiederholungen eine Schwellenwertlänge überschreiten. Da es kein Startcodon gibt, um den Leserahmen zu bestimmen, erfolgt die RAN-Übersetzung in allen Leserahmen sowohl aus Sense- als auch aus Antisense-RNA-Vorlagen, die eine wiederholte Erweiterungssequenz enthalten. Daher erweitert die RAN-Übersetzung die Anzahl möglicher krankheitsassoziierter toxischer Peptide von eins auf sechs. Bisher wurde die RAN-Übersetzung in acht verschiedenen wiederholten, erweiterungsbasierten neurodegenerativen und neuromuskulären Erkrankungen dokumentiert. In jedem Fall ist die Entschlüsselung der AL-Produkte, die toxisch sind, sowie ihrer Toxizitätsmechanismen ein entscheidender Schritt, um zu verstehen, wie diese Peptide zur Krankheitspathophysiologie beitragen. In diesem Beitrag stellen wir Strategien zur Messung der Toxizität von RAN-Peptiden im Modellsystem C. elegansvor. Zunächst beschreiben wir Verfahren zur Messung der RAN-Peptidtoxizität auf das Wachstum und die Beweglichkeit der Entwicklung von C. elegans. Zweitens beschreiben wir einen Test zur Messung postentwicklungsabhängiger, altersabhängiger Wirkungen von RAN-Peptiden auf die Beweglichkeit. Schließlich beschreiben wir einen Neurotoxizitätstest zur Bewertung der Auswirkungen von RAN-Peptiden auf die Neuronenmorphologie. Diese Assays bieten eine umfassende Bewertung der RAN-Peptidtoxizität und können für die Durchführung von groß angelegten genetischen oder kleinen Molekül-Screens nützlich sein, um Krankheitsmechanismen oder Therapien zu identifizieren.
Introduction
Die unangemessene Ausdehnung von DNA-Wiederholungssequenzen ist die genetische Grundlage für mehrere neurodegenerative Erkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS), frontotemporale Demenz (FTD) und Huntington (HD)1. Zwar gibt es etablierte Zell- und Tiermodelle für diese Krankheiten, Mechanismen, die diesen Bedingungen zugrunde liegen, sind jedoch nicht genau definiert. Beispielsweise wird DIE Huntington-Krankheit durch die Erweiterungeiner einer CAG-Wiederholungssequenz in der Codierungssequenz für das Huntingtin-Protein Htt2verursacht. Da CAG die Aminosäure Glutamin kodiert, führt die CAG-Wiederholungsexpansion zur Insertion einer Polyglutamin- oder PolyQ-Sequenz innerhalb von Htt. Erweiterte PolyQ-Proteine bilden längen- und altersabhängige Proteinaggregate, die mit Toxizität3,4verbunden sind. Überraschenderweise deuten zwei neuere Studien darauf hin, dass die Länge der PolyQ-Sequenz nicht der Haupttreiber des Auftretens von Huntington-Erkrankungen ist, was darauf hindeutet, dass polyQ-unabhängige Faktoren auch zur Krankheit beitragen können5,6.
Ein möglicher polyQ-unabhängiger Mechanismus beinhaltet eine neu entdeckte Art von Proteinübersetzung mit dem Begriff Repeat Associated Non-AUG-abhängige (RAN) Übersetzung7. Wie der Name schon sagt, tritt die RAN-Übersetzung nur auf, wenn eine erweiterte Wiederholungssequenz vorhanden ist und kein kanonisches Start-Codon erfordert. Daher erfolgt die RAN-Übersetzung in allen drei Leserahmen der Wiederholung, um drei unterschiedliche Polypeptide zu erzeugen. Da viele Gene auch ein Antisense-Transkript produzieren, das die umgekehrte Ergänzung der erweiterten Wiederholungssequenz enthält, findet sich die RAN-Übersetzung auch in allen drei Lesebildern des Antisense-Transkripts vor. Zusammen erweitert die RAN-Übersetzung die Anzahl der Proteine, die aus einer erweiterten, wiederholhaltigen DNA-Sequenz von einem Peptid auf sechs Peptide produziert werden. Bis heute wurde die RAN-Übersetzung bei mindestens acht verschiedenen Wiederholungsdehnungsstörungen beobachtet8. RAN-Peptide werden in postmortalen Patientenproben beobachtet und nur in Fällen, in denen der Patient eine erweiterte Wiederholung9,10trägt. Während diese Peptide eindeutig in Patientenzellen vorhanden sind, ist ihr Beitrag zur Krankheitspathophysiologie unklar.
Um die potenzielle Toxizität im Zusammenhang mit RAN-Peptiden besser zu definieren, haben mehrere Gruppen jedes Peptid in verschiedenen Modellsystemen wie Hefe, Fliegen, Mäusen und Gewebekulturzellen11,,12,13,,14,15,16exprimiert. Anstatt die Wiederholungssequenz für den Ausdruck zu verwenden, verwenden diese Modelle einen Codon-Variation-Ansatz, bei dem die Wiederholungssequenz eliminiert wird, aber die Aminosäuresequenz erhalten bleibt. Die Translationsinitiierung erfolgt durch ein kanonisches ATG und das Peptid wird in der Regel mit einem fluoreszierenden Protein am N- oder C-Terminus verschmolzen, von denen keines die RAN-Peptidtoxizität zu stören scheint. Daher überexpressest jedes Konstrukt ein einzelnes RAN-Peptid. Die Modellierung der verschiedenen RAN-Produkte in einem multizellulären Organismus mit einfachen Assays zur Messung der RAN-Peptidtoxizität ist von entscheidender Bedeutung, um zu verstehen, wie die verschiedenen RAN-Produkte aus jeder krankheitserregenden Wiederholungsexpansion zu zellulärer Dysfunktion und Neurodegeneration beitragen.
Wie andere Modellsysteme bietet C. elegans eine flexible und effiziente experimentelle Plattform, die Studien neuer Krankheitsmechanismen wie der RAN-Peptidtoxizität ermöglicht. Würmer bieten mehrere einzigartige experimentelle Attribute, die derzeit in anderen Modellen der RAN-Peptidtoxizität nicht verfügbar sind. Erstens sind C. elegans von der Geburt bis zum Tod optisch transparent. Dies ermöglicht eine einfache Visualisierung der RAN-Peptidexpression und -lokalisation sowie eine In-vivo-Analyse der Neurodegeneration bei lebenden Tieren. Zweitens sind transgene Methoden zur Erzeugung von RAN-Peptidexpressionsmodellen kostengünstig und schnell. Angesichts des kurzen dreitägigen Lebenszyklus von C. eleganskönnen stabile transgene Linien, die ein bestimmtes RAN-Peptid zellspezifisch exdrücken, in weniger als einer Woche hergestellt werden. Drittens können einfache phänotypische Outputs mit genetischen Screening-Methoden wie chemischer Mutagenese oder RNAi-Screening kombiniert werden, um Schnell Gene zu identifizieren, die für die RAN-Peptidtoxizität unerlässlich sind. Schließlich ermöglicht die kurze Lebensdauer von C. elegans (ca. 20 Tage) den Forschern zu bestimmen, wie das Altern, das der größte Risikofaktor für die meisten wiederholten Expansionskrankheiten ist, die TOXIZITÄT des RAN-Peptids beeinflusst. Zusammen ist diese Kombination von experimentellen Attributen in jedem anderen Modellsystem unübertroffen und bietet eine leistungsstarke Plattform für die Untersuchung der RAN-Peptidtoxizität.
Hier beschreiben wir mehrere Assays, die die experimentellen Vorteile von C. elegans nutzen, um die Toxizität von RAN-Peptiden zu messen und genetische Modifikatoren dieser Toxizität zu identifizieren. Die kodon-verschiedenen ATG-initiierten RAN-Peptide werden mit GFP markiert und entweder in Muskelzellen unter dem Myo-3-Promotor oder in GABAergen Motorneuronen unter dem unc-47-Promotor einzeln exprimiert. Für die Expression in Muskelzellen ist es wichtig, dass toxische RAN-Peptide mit grünem fluoreszierendem Protein (GFP) oder einem anderen Fluoreszenzprotein-Tag (FP) markiert werden, das mit einem RNAi-Fütterungsvektor gezielt werden kann. Dies liegt daran, dass die toxische RAN-Peptidexpression in der Regel das Wachstum blockiert und solche Belastungen nicht lebensfähig macht. Die Verwendung von gfp(RNAi) inaktiviert bedingt die RAN-Peptidexpression und ermöglicht Dehnungserhaltung, genetische Kreuze usw. Für Assays werden diese Tiere aus gfp(RNAi)entfernt, was die Expression des RAN-Peptids und der resultierenden Phänotypen ermöglicht. Zusätzlich zu der molekularen Strategie zur Gestaltung kodon-variierter RAN-Peptidexpressionskonstrukte beschreiben wir Assays zur Messung der Entwicklungstoxizität (Larval Motilität und Wachstumstest), post-entwicklungsbedingten altersassoziierten Toxizitäten (Paralyse-Assay) und neuronmorphologischen Defekten (Commissure Assay).
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier berichten wir Methoden, die verwendet werden können, um RAN Peptid Toxizität im Muskel oder in den Neuronen von C. elegansmodelliert assay. Während neurodegenerative Proteine bei menschlichen Patienten einen altersbedingten Phänotyp haben, können sie auch eine entwicklungsfördernde Weise aufweisen, wenn sie in Modellsystemen überexprimiert werden. Überexpression hat erhebliche interpretatole Einschränkungen, aber es bietet auch einen starken Ausgangspunkt für genetische oder pharmakologische Scree…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R21NS107797
Materials
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile | CELLTREAT Scientific Products | 50-202-036 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAR GRANULATED 2KILOGRAM | BD DIAGNOSTIC SYSTEMS | DF0145070 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAROSE ULTRAPURE | LIFE TECHNOLOGIES | 16500500 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| CARBENICILLIN 5G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP26485 | Nematode growth plates and RNAi |
| COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK | THERMO SCI ERIE | 12542B | Imaging for commissure assay |
| FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242952008 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK | THERMO SCI ERIE | 125485C | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | THERMO SCI ERIE | 12-550-15 | Imaging for commissure assay |
| Gibco Bacto Peptone | Gibco | DF0118-17-0 | Nematode growth plates and RNAi |
| HALOCARBON OIL 700 | SIGMA-ALDRICH INC | H8898-50ML | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| IPTG BIOTECH 10G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP162010 | Nematode growth plates and RNAi |
| Leica Advanced Fluorescence imaging software | Leica Microsystems | LAS-AF | Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay |
| Leica Immersion type N (Oil) | W NUHSBAUM INC | NC9547002 | Imaging for commissure assay |
| LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR | THERMO SCI ACROS ORGANICS | AC187870100 | Imaging for commissure assay |
| MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242956003 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
PETRI DISH, 60X15MM,500/CS |
CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC | FB0875713A | Nematode growth plates and RNAi |
| TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS | CORNING LIFE SCIENCES DL | 87721 | Nematode growth plates and RNAi |
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