Medição da Toxicidade do Peptídeo RAN em C. elegans
Summary
Os produtos translacionais não dependentes do ATG são características patogênicas emergentes de várias doenças baseadas em expansão repetida. O objetivo do protocolo descrito é avaliar a toxicidade causada por esses peptídeos utilizando ensaios comportamentais e celulares no sistema modelo C. elegans.
Abstract
C. elegans é comumente usado para modelar doenças neurodegenerativas relacionadas à idade causadas por mutações de expansão repetidas, como a Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) e a doença de Huntington. Recentemente, o RNA contendo expansão repetida mostrou-se o substrato para um novo tipo de tradução proteica chamada tradução não-dependente de AUG (RAN). Ao contrário da tradução canônica, a tradução RAN não requer um codon inicial e só ocorre quando as repetições excedem um comprimento de limiar. Como não há codon de início para determinar o quadro de leitura, a tradução RAN ocorre em todos os quadros de leitura tanto de modelos de RNA de sentido quanto de RNA antissentido que contêm uma seqüência de expansão repetida. Portanto, a tradução ran expande o número de possíveis peptídeos tóxicos associados à doença de um para seis. Até agora, a tradução ran foi documentada em oito diferentes doenças neurodegenerativas e neuromusculares baseadas em expansão. Em cada caso, decifrar quais produtos RAN são tóxicos, bem como seus mecanismos de toxicidade, é um passo crítico para entender como esses peptídeos contribuem para a fisiopatologia da doença. Neste artigo, apresentamos estratégias para medir a toxicidade dos peptídeos RAN no sistema modelo C. elegans. Em primeiro lugar, descrevemos procedimentos para medir a toxicidade do peptídeo RAN sobre o crescimento e a motilidade do desenvolvimento de C. elegans. Em segundo lugar, detalhamos um ensaio para medir efeitos pós-desenvolvimento, dependentes da idade dos peptídeos RAN sobre a motilidade. Finalmente, descrevemos um ensaio de neurotoxicidade para avaliar os efeitos dos peptídeos ran na morfologia dos neurônios. Esses ensaios fornecem uma ampla avaliação da toxicidade do peptídeo RAN e podem ser úteis para a realização de telas genéticas ou pequenas moléculas em larga escala para identificar mecanismos ou terapias de doenças.
Introduction
A expansão inadequada das sequências de repetição do DNA é a base genética para várias doenças neurodegenerativas, como a esclerose lateral amiotrófica (ELA), a demência frontotemporal (TFT) e a doença de Huntington (HD)1. Embora existam modelos celulares e animais estabelecidos para essas doenças, os mecanismos subjacentes a essas condições não são bem definidos. Por exemplo, o HD é causado pelas expansões de uma seqüência de repetição CAG na seqüência de codificação para a proteína Huntingtin Htt2. Como o CAG codifica a glutamina de aminoácidos, a expansão de repetição do CAG resulta na inserção de uma seqüência de poliglutamina, ou poliQ, dentro de Htt. Proteínas poliQ expandidas formam agregados proteicos dependentes de comprimento e idade que estão associados à toxicidade3,4. Surpreendentemente, dois estudos recentes sugerem que o comprimento da seqüência de poliQ não é o principal condutor do início da doença de HD, sugerindo que fatores independentes do poliQ também podem contribuir para a doença5,6.
Um possível mecanismo independente de poliQ envolve um tipo recém-descoberto de tradução proteica denominado Repeat Asociated Non-AUG-dependent (RAN) tradução7. Como o nome indica, a tradução RAN só ocorre quando uma seqüência de repetição expandida está presente e não requer um códon de partida canônico. Portanto, a tradução RAN ocorre em todos os três quadros de leitura da repetição para produzir três polipeptídeos distintos. Além disso, como muitos genes também produzem uma transcrição anti-sentido que contém o complemento reverso da seqüência de repetição expandida, a tradução RAN também ocorre em todos os três quadros de leitura da transcrição antisense. Em conjunto, a tradução ran expande o número de proteínas produzidas a partir de uma seqüência de DNA repetitiva expandida de um peptídeo para seis peptídeos. Até o momento, a tradução ran foi observada em pelo menos oito diferentes distúrbios de expansão repetitiva8. Os peptídeos RAN são observados em amostras de pacientes pós-morte e somente nos casos em que o paciente carrega uma repetição expandida9,10. Embora esses peptídeos estejam claramente presentes nas células do paciente, sua contribuição para a fisiopatologia da doença não é clara.
Para melhor definir a potencial toxicidade associada aos peptídeos RAN, vários grupos expressaram cada peptídeo em vários sistemas modelo, como leveduras, moscas, camundongos e células de cultura tecidual11,,12,,13,,14,,15,16. Em vez de utilizar a seqüência de repetição para expressão, esses modelos empregam uma abordagem de variação de códon em que a seqüência de repetição é eliminada, mas a seqüência de aminoácidos é preservada. A iniciação da tradução ocorre através de um ATG canônico e o peptídeo é tipicamente fundido a uma proteína fluorescente no N- ou C-terminus, nenhum dos quais parece interferir com a toxicidade do peptídeo RAN. Portanto, cada construção superexpressa um único peptídeo RAN. Modelar os diferentes produtos RAN em um organismo multicelular com ensaios simples para medir a toxicidade do peptídeo RAN é de vital importância para entender como os diferentes produtos RAN de cada expansão repetitiva causadora de doenças contribuem para a disfunção celular e neurodegeneração.
Como outros sistemas modelo, C. elegans fornece uma plataforma experimental flexível e eficiente que permite estudos de novos mecanismos de doença, como a toxicidade do peptídeo RAN. Os worms oferecem vários atributos experimentais únicos que não estão disponíveis atualmente em outros modelos de toxicidade do peptídeo RAN. Primeiro, c. elegans são opticamente transparentes desde o nascimento até a morte. Isso permite a visualização simples da expressão e localização do peptídeo RAN, bem como a análise in vivo da neurodegeneração em animais vivos. Em segundo lugar, os métodos transgênicos para a geração de modelos de expressão de peptídeos RAN são baratos e rápidos. Dado o curto ciclo de vida de três dias de C. elegans,linhas transgênicas estáveis expressando qualquer peptídeo RAN dado de forma específica do tipo celular podem ser produzidas em menos de uma semana. Em terceiro lugar, as saídas pheotípicas simples podem ser combinadas com métodos de triagem genética, como mutagênese química ou triagem RNAi, para identificar rapidamente genes essenciais para a toxicidade do peptídeo RAN. Finalmente, a curta vida útil de C. elegans (~20 dias) permite que os pesquisadores determinem como o envelhecimento, que é o maior fator de risco para a maioria das doenças de expansão repetida, influencia a toxicidade do peptídeo RAN. Juntos, essa combinação de atributos experimentais é incomparável em qualquer outro sistema de modelo e oferece uma plataforma poderosa para o estudo da toxicidade do peptídeo RAN.
Aqui descrevemos vários ensaios que aproveitam as vantagens experimentais de C. elegans para medir a toxicidade dos peptídeos RAN e identificar modificadores genéticos dessa toxicidade. Os peptídeos RAN iniciados pelo códon ATG são marcados com GFP e expressos individualmente em células musculares sob o promotor do mio-3 ou em neurônios motores GABAergic sob o promotor unc-47. Para a expressão em células musculares, é importante que os peptídeos RAN tóxicos sejam marcados com proteína fluorescente verde (GFP), ou outra etiqueta de proteína fluorescente (FP) que pode ser direcionada com um vetor de alimentação RNAi. Isso porque a expressão tóxica do peptídeo RAN geralmente bloqueia o crescimento, tornando tais cepas inviáveis. O uso de gfp(RNAi) inativa condicionalmente a expressão do peptídeo RAN e permite a manutenção de cepas, cruzes genéticas, etc. Para ensaios, esses animais são removidos do gfp(RNAi),que permite a expressão do peptídeo RAN e dos fenótipos resultantes. Além da estratégia molecular para projetar construções de expressão ran-variadas de códon, descrevemos ensaios para medir toxicidade do desenvolvimento (motilidade larval e ensaio de crescimento), toxicidade associada à idade pós-desenvolvimento (ensaio de paralisia) e defeitos morfológicos neuronológicos (ensaio de comissure).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui relatamos métodos que podem ser usados para ensaio da toxicidade do peptídeo RAN modelado no músculo ou nos neurônios de C. elegans. Embora as proteínas neurodegenerativas tenham um fenótipo de início de idade em pacientes humanos, elas também podem exibir toxicidade de desenvolvimento quando superexpressas em sistemas modelo. A superexpressão tem limitações interpretativos significativas, mas também fornece um ponto de partida poderoso para telas genéticas ou farmacológicas destinadas a ident…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R21NS107797
Materials
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile | CELLTREAT Scientific Products | 50-202-036 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAR GRANULATED 2KILOGRAM | BD DIAGNOSTIC SYSTEMS | DF0145070 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAROSE ULTRAPURE | LIFE TECHNOLOGIES | 16500500 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| CARBENICILLIN 5G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP26485 | Nematode growth plates and RNAi |
| COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK | THERMO SCI ERIE | 12542B | Imaging for commissure assay |
| FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242952008 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK | THERMO SCI ERIE | 125485C | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | THERMO SCI ERIE | 12-550-15 | Imaging for commissure assay |
| Gibco Bacto Peptone | Gibco | DF0118-17-0 | Nematode growth plates and RNAi |
| HALOCARBON OIL 700 | SIGMA-ALDRICH INC | H8898-50ML | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| IPTG BIOTECH 10G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP162010 | Nematode growth plates and RNAi |
| Leica Advanced Fluorescence imaging software | Leica Microsystems | LAS-AF | Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay |
| Leica Immersion type N (Oil) | W NUHSBAUM INC | NC9547002 | Imaging for commissure assay |
| LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR | THERMO SCI ACROS ORGANICS | AC187870100 | Imaging for commissure assay |
| MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242956003 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
PETRI DISH, 60X15MM,500/CS |
CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC | FB0875713A | Nematode growth plates and RNAi |
| TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS | CORNING LIFE SCIENCES DL | 87721 | Nematode growth plates and RNAi |
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