使用主机范围和视觉选择快速、无缝地生成重组痘病毒
Summary
这是一种使用宿主范围选择和重组病毒的可视化识别来生成”无疤痕”重组病毒的方法。
Abstract
Vaccinia病毒（VACV）有助于从自然中根除天花的病原体变异病毒（VARV）。VACV自首次作为疫苗使用以来，一直作为治疗性疫苗的载体和溶血性病毒而开发。这些应用利用 VACV 易于操作的基因组和广泛的主机范围，作为一个出色的平台，以生成具有各种治疗应用的重组病毒。已经开发了几种方法来生成重组VACV，包括标记选择方法和瞬态显性选择。在这里，我们介绍了主机范围选择方法的改进，以及重组病毒的可视化识别。我们的方法利用宿主抗病毒蛋白激酶R（PKR）产生的选择性压力，加上荧光融合基因，表达mCherry标记的E3L，这是两个VACV PKR拮抗剂之一。盒式磁带，包括感兴趣的基因和mCherry-E3L融合，由从VACV基因组派生的序列组成。感兴趣的基因和mCherry-E3L是一个较小的区域，与3’臂的前150个核苷酸相同，促进mCherry-E3L基因在选择后的同源重组和丢失。我们证明，这种方法允许在各种细胞类型中高效、无缝地生成 rVACV，而无需选择药物或广泛筛选突变病毒。
Introduction
Vaccinia病毒（VACV）有助于首次成功地从自然界中消灭人类病原体变异病毒（VARV）。自从病毒灭绝以来，包括VACV在内的痘病毒一直为人类和动物医学提供有用的治疗病毒。例如，基于VACV的狂犬病病毒疫苗在防止神经病性狂犬病在欧洲1和美国2的传播方面非常有效。最近，反应各种抗肿瘤分子（如单链抗体或人类红细胞生成素）的重组痘病毒作为溶血剂33、4、54,5取得了令人鼓舞的成功。VACV作为载体特别有吸引力，因为它容易受遗传操作，具有广泛的宿主范围，在各种条件下保持稳定，便于运输和疫苗在6、77领域的生存能力。虽然已经开发出多种技术来生成用于实验室实验和疫苗生成的重组VACV，但目前产生这些病毒的策略有显著的局限性。
由于VACV的效用，开发了多种生成重组病毒的策略。第一种策略采用同源重组来引入一种盒式磁带，包括转基因和可选标记基因，如抗生素耐药性基因。盒式磁带的两个+500核苷酸（nt）或更大的手臂将基因定向到病毒基因组中的特定部位，然后通过双交叉事件88、9、109,10进行稳稳地集成。这一战略是快速和高效的;然而，它产生额外的遗传物质的形式标记基因，可能产生意想不到的效果。此外，转基因数量有实际的上限，可以引入的转基因标记数量受可用独特可选择标记的数量限制。瞬时主导选择（TDS）策略通过促进”无痕”重组病毒的生成解决了这一问题。使用这种策略，包含突变VACV基因和可选择标记基因的质粒被集成到病毒基因组中，但没有额外的侧翼VACVDNA。这种方法导致整个质粒的暂时整合和VACV基因的重复，由于单个交叉事件的整合。这种中间体是稳定的，只要它在选择压力下保持，允许此构造的丰富。移除选择后，VACV 复制启用第二个交叉事件，导致以大约 50：50 的比例去除质粒并随后形成野生类型 （wt） 或重组病毒。虽然TDS生成重组病毒而无需稳定引入外来DNA，但多个病毒克隆必须通过测序分析筛选出预期的突变，这一步骤可能耗时且成本高昂。
在这里，我们提出了一种生成重组痘病毒的方法，结合每种方法的最佳方面，类似于为复制无能的、经过修改的安卡拉12、13、14,14所述的方法。12,此策略结合了视觉和宿主范围选择，通过双交叉事件快速生成重组病毒，然后通过同源重组消除可选标记基因。这种方法允许由同源重组促进的突变体的快速生成，具有TDS方法的”无痕”性质，同时无需随后的筛选步骤来区分野生病毒和突变病毒。我们的方法还采用宿主范围选择代替抗生素选择，消除了细胞系中化学诱导的型比变化的风险。对于这种方法，我们选择使用宿主抗病毒蛋白激酶R（PKR）作为选择性剂，以产生重组VACV。在大多数单元格类型15中，PKR 表示为非活动单体。在N-终端dsRNA结合域中结合双链RNA（dsRNA）时，PKR变暗，并自磷化16。这种活性形式的PKR磷酸酶酶启动因子2（eIF2）的α亚单位，最终抑制启动器二甲酰-tRNA的传递，从而防止细胞内翻译，并广泛抑制许多病毒家族17，18,18的复制。
为了应对PKR广泛而有效的抗病毒活性，许多病毒至少进化了一种防止PKR激活的策略。大多数痘病毒表达两个PKR拮抗剂，由VACV中的E3L和K3L基因编码，通过两种不同的机制19对抗PKR。E3通过结合双链RNA20，2121来防止20PKR消增，而K3则通过直接结合到激活的PKR，从而抑制与其基质eIF2+22的相互作用，作为伪22基质抑制剂。重要的是，这两个PKR拮抗剂不一定能抑制所有物种的PKR。例如，羊痘病毒的K3同源性强抑制羊的PKR，而羊痘E3同源性没有表现出相当大的PKR抑制23，24。23,在这项研究中，我们提出了一种使用PKR介导选择性压力与荧光选择相结合的方法，为E3L和K3L（VC-R4）生成一种VACV重组，这种重组不能在从不同物种衍生的PKR合格细胞中复制。这种重组病毒为快速生成重组病毒提供了极好的背景，这些病毒表达由原生E3L启动器控制的基因。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们提出了一个瞬态标记选择策略32的变化，以生成重组性气喘病毒，而不保留外来DNA在最后重组病毒。我们的策略使用由宿主抗病毒蛋白PKR介导的选择性压力，而不是其他形式的选择性压力，如抗生素。使用宿主抗病毒基因消除了细胞中化学诱导的型物变化的可能性，或由于选择药物而增加突变的风险。此外，与药物选择不同，我们的方法没有滞后阶段，因为PKR在所?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该项目由国家卫生研究院（AI114851）资助至SR。
Materials
| 2X-Q5 Master Mix | NEB | M0492L | High-fidelity polymerase used in PCR |
| Ampicillin | ThermoFisher Scientific | 11593027 | Bacterial selective agent |
| Disposable Cell Scrapers | ThermoFisher Scientific | 08-100-242 | Cell scraper to harvest infected cells |
| EVOS FL Auto 2 Cell imaging system | ThermoFisher Scientific | AMAFD2000 | Fluorescent microscope |
| EVOS Light Cube, GFP | ThermoFisher | AMEP4651 | GFP Cube |
| EVOS Light Cube, RFP | ThermoFisher | AMEP4652 | RFP Cube |
| GenJet | SignaGen Laboratories | SL100489 | Transfection reagent |
| Luria Bertani (LB) Broth | Gibco | 10855021 | Bacterial growth medium |
| Monarch DNA gel extraction kit | NEB | T1020L | Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors |
| Monarch Plasmid Miniprep kit | NEB | T1010L | Miniprep kit ussed to purify plasmids |
| NanoDrop One | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration |
| NEBuilder Master Mix | NEB | E2621L | Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector |
| Q500 Sonicator | Qsonica | Q500-110 | Sonicator for virus lysates |
| RK13 cells | ATCC | CCL-37 | Rabbit kidney cells |
| VWR Multiwell Cell Culture plates | VWR | 10062-892 | Cell culture plates |
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