호스트 범위 및 시각적 선택을 사용하여 신속하고 원활한 재조합 Poxviruses 생성
Summary
이는 재조합 바이러스의 호스트 범위 선택 및 시각적 식별을 사용하여 “무소” 재조합 백시니아 바이러스를 생성하는 방법이다.
Abstract
백시니아 바이러스 (VACV)는 자연에서 천연두의 원인 인 바리올라 바이러스 (VARV)를 근절하는 데 중요한 역할을했습니다. 백신으로 처음 사용된 이후, VACV는 치료 백신및 온용해 바이러스의 벡터로 개발되었습니다. 이러한 응용 분야는 VACV의 쉽게 조작할 수 있는 게놈 및 광범위한 숙주 범위를 다양한 치료 응용 분야와 함께 재조합 바이러스를 생성하는 뛰어난 플랫폼으로 활용합니다. 마커 선택 방법 및 과도 지배적 선택을 포함하여 재조합 VACV를 생성하기 위해 여러 가지 방법이 개발되었습니다. 여기서, 재조합 바이러스의 시각적 식별과 결합된 숙주 범위 선택 방법의 구체화를 제시한다. 우리의 방법은 mCherry 태그E3L를 발현하는 형광 융합 유전자와 결합된 숙주 항바이러스 단백질 키나제 R(PKR)에 의해 생성된 선택적 압력을 활용하며, 두 개의 VACV PKR 길항제 중 하나이다. 관심 있는 유전자 및 mCherry-E3L 융합을 포함하는 카세트는 VACV 게놈으로부터 유래된 서열에 의해 측면화된다. 관심 유전자와 mCherry-E3L 사이에는 3′ 암의 제1~150뉴클레오티드와 동일한 더 작은 영역이며, 선택 후 mCherry-E3L 유전자의 상동성 재조합 및 손실을 촉진한다. 당사는 이 방법이 돌연변이 바이러스에 대한 약물 선택 또는 광범위한 스크리닝을 요구하지 않고 다양한 세포 유형에서 효율적이고 원활한 rVACV 생성을 허용한다는 것을 입증합니다.
Introduction
백시니아 바이러스 (VACV)는 자연에서 인간 병원균, 바리올라 바이러스 (VARV)의 첫 번째 성공적인 박멸을위한 도구였다. 바리올라 바이러스의 박멸 이후, VACV를 포함한 백스바이러스는 인간 및 동물 의학 모두에 유용한 치료 바이러스로 계속 되어 왔습니다. 예를 들어, VACV 기반 광견병 바이러스 백신은 유럽1 및 미국2에서실바틱 광견병의 전염을 방지하는 데 매우 효과적이었다. 보다 최근에는 다양한 항종양 분자(예를 들어, 단일 사슬 항체 또는 인간 에리스로포이에틴)를 발현하는 재조합 백혈바이러스가 종양용해제3,,4,,5로서의욕적인 성공을 보이고 있다. VACV는 유전자 조작에 용이하게 순종할 수 있고, 광범위한 숙주 범위를 보유하며, 다양한 조건하에서 안정되어, 현장에서 의 수송 및 백신 생존이 용이하기 때문에 벡터로서 특히 매력적이다6,,7. 실험실 실험 및 백신 생성을 위한 재조합 VACV를 생성하기 위하여 다중 기술이 개발된 동안, 이 바이러스를 생성하는 현재 전략은 주목할 만한 한계가 있습니다.
VACV의 유용성 으로 인해 재조합 바이러스를 생성하는 여러 전략이 개발되었습니다. 첫번째 전략은 항생 저항 유전자와 같은 이식유전자 및 선택 가능한 마커 유전자를 포함하는 카세트를 소개하기 위하여 상동 재조합을 이용합니다. 카세트는 2~500개의 뉴클레오티드(nt) 또는 더 큰 암에 의해 측면이 바이러스 게놈내의 특정 부위로 유전자를 지시하고, 이어서 이중 크로스오버 이벤트8,,9,,10에의해 안정적으로 통합된다. 이 전략은 빠르고 효율적입니다. 그러나, 그것은 예기치 않은 효력을 생성할 수 있는 마커 유전자의 양식에 있는 추가 유전 물자 초래합니다. 더욱이, 유효한 고유 선택 가능한 마커의 수에 의해 제한될 수 있는 트랜스게네의 수에 대한 실질적인 상한이 있다. 과도 지배적 인 선택 (TDS) 전략은 “무모”재조합 바이러스의 생성을 촉진하여이 문제를해결11. 이 전략을 사용하여, 돌연변이 VACV 유전자 및 선택 가능한 마커 유전자를 포함하는 플라스미드는 바이러스 게놈으로 통합되지만, 추가적인 측면 VACV DNA는 없이 통합된다. 이러한 접근법은 단일 크로스오버 이벤트에 의한 통합의 결과로 VACV 유전자의 전체 플라스미드 및 복제의 과도 적분을 초래한다. 이 중간은 선택 압력하에서 유지되는 한 안정적이며, 이 구제의 농축을 허용합니다. 선택이 제거되면, VACV 중복은 약 50:50 비율로 야생 형 (wt) 또는 재조합 바이러스 중 하나의 플라스미드 및 후속 형성의 제거를 초래하는 두 번째 크로스 오버 이벤트를 가능하게한다. TDS는 외국 DNA의 안정한 소개를 요구하지 않고 재조합 바이러스를 생성하는 동안, 다중 바이러스 클론은 시퀀싱 분석에 의해 예상되는 돌연변이를 위해 가려져야 합니다, 잠재적으로 시간 소모적이고 비용이 많이 드는 단계.
여기서, 우리는 이러한 접근법의 각각의 가장 좋은 측면을 결합한 재조합 백스바이러스를 생성하는 접근법을 제시하며, 이는 복제가 무능한 변형백시니아 앙카라12,,13,,14에대해 기재된 접근법과 유사하다. 이 전략은 이중 크로스오버 이벤트에 의해 재조합 바이러스를 신속하게 생성하고, 이어서 상동 재조합에 의해 선택 가능한 마커 유전자를 제거하기 위해 시각 및 숙주 범위 선택을 결합한다. 이 접근법은 야생 유형과 돌연변이 바이러스를 구별하기 위한 후속 스크리닝 단계를 요구하지 않는 동안 TDS 접근법의 “무불한” 특성과 함께 상동 재조합에 의해 매개된 돌연변이체의 신속한 생성을 허용합니다. 우리의 방법은 또한 세포주에서 화학적으로 유도된 현상형 변경의 리스크를 제거하는 항생제 선택 대신에 호스트 범위 선택을 이용합니다. 이러한 접근법을 위해, 우리는 숙주 항바이러스 단백질 키나제 R(PKR)을 재조합 VACV를 생성하는 선택적 제제로서 사용하기로 선택하였다. PKR은 대부분의 세포 유형15에서비활성 단량체로 발현된다. N-말단 dsRNA 결합 도메인에서 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 결합하면 PKR은 이화되고16을자가 포설화된다. 이러한 활성 형태의 PKR 인산화는 진핵 개시 인자 2(eIF2)의 알파 소부를 궁극적으로 리보솜으로 의 이니시에이터 메티오닐-tRNA의 전달을 억제하고, 세포내 번역을 방지하고 많은 바이러스 군모의 복제를 광범위하게 억제한다17,,18.
PKR의 광범위하고 강력한 항바이러스 활성에 반응하여, 많은 바이러스는 PKR 활성화를 방지하기 위한 적어도 하나의 전략을 발전시키고 있다. 대부분의 백혈바이러스는 2개의 PKR 길항제를 발현하고, VACV에 있는 E3L 및 K3L 유전자에 의해 인코딩되고, 이는 2개의 명백한 기계장치19를통해 PKR을 적대합니다. E3는 이중 가닥 RNA20,,21,K3가 활성화된 PKR에 직접 결합하여 가성 기질 억제제로서 작용하여 PKR 을 결합하여 PKR 을 결합하여 PKR 을 상호작용을 방지하고 이에 의해 eIF2α22를억제한다. 중요한 것은, 이 두 PKR 길항제가 모든 종으로부터 PKR을 반드시 억제하는 것은 아니다. 예를 들어, 양두 바이러스로부터의 K3 호몰로그는 양으로부터 PKR을 강하게 억제한 반면, 양두 E3 상동체는 상당한 PKR 억제를 나타내지않았다(23,,24). 본 연구에서, 우리는 다양한 종에서 유래한 PKR 유능한 세포에서 복제할 수 없는 E3L 및 K3L(VC-R4)에 대해 삭제된 VACV 재조합을 생성하기 위해 형광 선택과 결합된 PKR 매개 선택적 압력을 사용하는 방법을 제시한다. 이러한 재조합 바이러스는 네이티브 E3L 프로모터의 제어 하에 유전자를 발현하는 재조합 바이러스의 신속한 생성을 위한 훌륭한 배경을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 우리는 최종 재조합 바이러스에서 외래 DNA를 유지하지 않고 재조합 백시니아 바이러스를 생성하기 위한 과도 마커 선택 전략(32)의 변이를 제시한다. 우리의 전략은 항생제와 같은 선택적 압력의 그밖 양식 보다는 오히려 호스트 항바이러스 단백질 PKR에 의해 중재된 선택적인 압력을 이용합니다. 숙주 항 바이러스 유전자의 사용은 세포에 화학적으로 유도 된 현상형 변화…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 SR에 국립 보건원 (AI114851)에 의해 투자되었다.
Materials
| 2X-Q5 Master Mix | NEB | M0492L | High-fidelity polymerase used in PCR |
| Ampicillin | ThermoFisher Scientific | 11593027 | Bacterial selective agent |
| Disposable Cell Scrapers | ThermoFisher Scientific | 08-100-242 | Cell scraper to harvest infected cells |
| EVOS FL Auto 2 Cell imaging system | ThermoFisher Scientific | AMAFD2000 | Fluorescent microscope |
| EVOS Light Cube, GFP | ThermoFisher | AMEP4651 | GFP Cube |
| EVOS Light Cube, RFP | ThermoFisher | AMEP4652 | RFP Cube |
| GenJet | SignaGen Laboratories | SL100489 | Transfection reagent |
| Luria Bertani (LB) Broth | Gibco | 10855021 | Bacterial growth medium |
| Monarch DNA gel extraction kit | NEB | T1020L | Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors |
| Monarch Plasmid Miniprep kit | NEB | T1010L | Miniprep kit ussed to purify plasmids |
| NanoDrop One | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration |
| NEBuilder Master Mix | NEB | E2621L | Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector |
| Q500 Sonicator | Qsonica | Q500-110 | Sonicator for virus lysates |
| RK13 cells | ATCC | CCL-37 | Rabbit kidney cells |
| VWR Multiwell Cell Culture plates | VWR | 10062-892 | Cell culture plates |
References
- Brochier, B., et al. Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine. Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).
- Pastoret, P. P., Brochier, B. The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur. Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).
- Chan, W. M., McFadden, G. Oncolytic Poxviruses. Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).
- Nguyen, D. H., et al. Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice. Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).
- Frentzen, A., et al. Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).
- Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. Poxviruses as vaccine vectors. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).
- COLLIER, L. H. The development of a stable smallpox vaccine. The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).
- Weir, J. P., Bajszár, G., Moss, B. Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).
- Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).
- Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).
- Falkner, F. G., Moss, B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).
- Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara. BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).
- Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. Construction and Isolation of Recombinant MVA. Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).
- Di Lullo, G., et al. Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).
- Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response. Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).
- Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A – G mismatch and noncontigous helixes. Biochimie. 37 (18), 6303-6316 (1998).
- Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation. Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).
- Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. Evolution of eIF2α kinases: Adapting translational control to diverse stresses. Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).
- Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. A survey of host range genes in poxvirus genomes. Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).
- Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).
- Romano, P. R., et al. Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain. Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).
- Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon. Virology. 183 (1), 419-422 (1991).
- Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus. Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).
- Rothenburg, S., Brennan, G. Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence. Trends in Microbiology. , (2019).
- Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression. BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).
- Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA). Biochimie. 86, 2172-2175 (1989).
- Chung, C. T., Miller, R. H. Preparation and storage of competent Escherichia coli cells. Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).
- Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication. PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465 (2013).
- Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells. Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).
- Ball, L. A. High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA. Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).
- Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells. Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).
- Liu, L., et al. Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus. BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).
