Быстрое, бесшовное поколение рекомбинантных поксвирусов с использованием диапазона хоста и визуального отбора
Summary
Это метод для создания “безшрамов” рекомбинантных вирусов vaccinia с использованием выбора хоста и визуальной идентификации рекомбинантных вирусов.
Abstract
Вирус Вакцинии (VACV) сыграл важную роль в искоренении вируса вариолы (VARV), возбудителя оспы, от природы. С момента своего первого использования в качестве вакцины, VACV был разработан в качестве переносчика терапевтических вакцин и в качестве онколитического вируса. Эти приложения используют легко управляемый геном VACV и широкий диапазон хост в качестве выдающейся платформы для создания рекомбинантных вирусов с различными терапевтическими приложениями. Для создания рекомбинантного VACV было разработано несколько методов, включая методы выбора маркеров и переходный доминирующий выбор. Здесь мы представляем уточнение метода выбора диапазона хоста в сочетании с визуальной идентификацией рекомбинантных вирусов. Наш метод использует селективное давление, генерируемое принимающей противовирусной протеиной киназы R (PKR) в сочетании с флуоресцентным геном синтеза, выражающим mCherry-tagged E3L, один из двух антагонистов VACV PKR. Кассета, включая интересуемый ген и слияние mCherry-E3L, окружена последовательностями, полученными из генома VACV. Между геном интереса и mCherry-E3L находится меньшая область, идентичная первым нуклеотидам 3′ руки, чтобы способствовать гомологионной рекомбинации и потере гена mCherry-E3L после отбора. Мы демонстрируем, что этот метод позволяет эффективное, бесшовное генерации rVACV в различных типах клеток, не требуя отбора лекарств или тщательного скрининга на вирусы-мутанты.
Introduction
Вирус Ваккиния (VACV) сыграл важную роль в первом успешном искоренении патогена человека, вируса вариолы (VARV), от природы. С момента уничтожения вируса вариолы, поксвирусы, включая VACV, продолжают быть полезными терапевтическими вирусами как для медицины человека, так и для животных. Например, вакцина против бешенства на основе VACV была очень эффективной в предотвращении передачи сильватического бешенства в Европе1 и Соединенных Штатах2. Совсем недавно, рекомбинантные поксвирусы, выражающие различные противоопухолевые молекулы (например, одноцепные антитела или человеческий эритропоэтин) видели обнадеживающий успех, как онколитические агенты3,4,5. VACV особенно привлекателен в качестве вектора, потому что он легко поддается генетическим манипуляциям, обладает широким диапазоном хостов, и он стабилен в различных условиях, что позволяет легко транспортировать и жизнеспособность вакцины в поле6,7. Хотя было разработано несколько методов для создания рекомбинантных VACV для лабораторных экспериментов и создания вакцин, нынешние стратегии создания этих вирусов имеют заметные ограничения.
Из-за полезности VACV, несколько стратегий для создания рекомбинантных вирусов были разработаны. Первая стратегия использует гомологию рекомбинации для введения кассеты, включая трансген и выбираемый ген маркера, такой как ген устойчивости к антибиотикам. Кассета окружена двумя нуклеотидами (nt) или более крупными руками, направляющими ген к определенному участку в вирусном геноме, который затем прочно интегрируется двойными событиями кроссовера8,,9,,10. Эта стратегия является быстрой и эффективной; однако, это приводит к дополнительному генетическому материалу в виде гена маркера, который может привести к неожиданным эффектам. Кроме того, существует практический верхний предел числа трансгенов, который может быть введен ограниченным числом уникальных доступных маркеров. Переходный доминирующий выбор (TDS) стратегии рассмотрели этот вопрос путем облегчения генерации “безшрамов” рекомбинантных вирусов11. Используя эту стратегию, плазмида, содержащая мутантный ген VACV и выбираемый ген маркера, интегрирована в вирусный геном, но без дополнительного флангового ДНК VACV. Такой подход приводит к переходной интеграции всей плазмиды и дублированию гена VACV в результате интеграции одним событием кроссовера. Этот промежуточный является стабильным до тех пор, пока он поддерживается под давлением отбора, что позволяет обогащать эту конструкцию. При удалении выбора дублирование VACV позволяет второе событие кроссовера, что приводит к удалению плазмиды и последующему образованию либо дикого типа (WT) или рекомбинантного вируса в приблизительном соотношении 50:50. В то время как TDS генерирует рекомбинантные вирусы, не требуя стабильного внедрения чужеродных ДНК, несколько клонов вирусов должны быть проверены на ожидаемую мутацию путем секвенирования анализа, потенциально отнимающего много времени и дорогостоящий шаг.
Здесь мы представляем подход к генерации рекомбинантных поксвирусов, сочетающих лучшие аспекты каждого из этих подходов, похожий на подход, который был описан для репликации некомпетентных модифицированных vaccinia Анкара12,13,14. Эта стратегия сочетает в себе визуальный выбор диапазона и диапазона хоста для быстрого генерации рекомбинантных вирусов путем двойного кроссовера событий, а затем устранить выбираемый ген маркера гомологической рекомбинации. Такой подход позволяет быстрое поколение мутантов, опосредованное гомологичным рекомбинацией, с “безшрамным” характером подходов TDS, не требуя при этом последующего этапа скрининга для различения вирусов дикого типа и мутантов. Наш метод также использует выбор диапазона хоста вместо выбора антибиотиков, устраняя риск химически индуцированных фенотипических изменений в клеточной линии. Для этого подхода мы решили использовать противовирусную протеину киназы R (PKR) в качестве селективного агента для создания рекомбинантного VACV. PKR выражается как неактивный мономер в большинстве типов клеток15. При связывании двухцепочечной РНК (dsRNA) в N-терминалd dsRNA-связывающих доменов, PKR димеризирует и аутофосфорилируется16. Эта активная форма PKR фосфорилаты альфа-субъединицу эукариотического фактора инициации 2 (eIF2), в конечном счете, препятствуя доставке инициатора метионил-ТРНА к рибосоме, тем самым предотвращая внутриклеточный перевод и широко препятствуя репликации многих вирусных семейст. 17,18.
В ответ на широкую и мощную противовирусную активность PKR, многие вирусы разработали по крайней мере одну стратегию для предотвращения активации PKR. Большинство поксвирусов выражают два антагониста PKR, кодируемого генами E3L и K3L в VACV, которые антагонизируют PKR через два различных механизма19. E3 предотвращает гомемеризацию PKR путем связывания двухцепочечной РНК20,21, в то время как K3 действует как ингибитор псевдосубстрата, связывая непосредственно с активированным PKR и тем самым препятствуя взаимодействию с его субстратом eIF2 ‘22. Важно отметить, что эти два антагонистов PKR не обязательно подавляют PKR от всех видов. Например, Гомолог K3 от вируса овцеводческой оспы сильно ингибирует PKR от овец, в то время как овчарка E3 омолог не показал значительного торможения PKR23,24. В этом исследовании мы представляем метод использования PKR-опосредованного селективного давления в сочетании с выбором флуоресценции для создания рекомбинантного VACV, удаленного для E3L и K3L (VC-R4), который не может реплицироваться в компетентных клетках PKR, полученных из различных видов. Этот рекомбинантный вирус обеспечивает отличный фон для быстрого поколения рекомбинантных вирусов, выражающих гены под контролем родного E3L-промоутера.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем вариации переходного маркера стратегии выбора 32 для создания рекомбинантных вирусов vaccinia без сохранения чужеродных ДНК в окончательном рекомбинантный вирус. Наша стратегия использует селективное давление при посредничестве принимающей противови?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект был профинансирован Национальными институтами здравоохранения (AI114851) в СР.
Materials
| 2X-Q5 Master Mix | NEB | M0492L | High-fidelity polymerase used in PCR |
| Ampicillin | ThermoFisher Scientific | 11593027 | Bacterial selective agent |
| Disposable Cell Scrapers | ThermoFisher Scientific | 08-100-242 | Cell scraper to harvest infected cells |
| EVOS FL Auto 2 Cell imaging system | ThermoFisher Scientific | AMAFD2000 | Fluorescent microscope |
| EVOS Light Cube, GFP | ThermoFisher | AMEP4651 | GFP Cube |
| EVOS Light Cube, RFP | ThermoFisher | AMEP4652 | RFP Cube |
| GenJet | SignaGen Laboratories | SL100489 | Transfection reagent |
| Luria Bertani (LB) Broth | Gibco | 10855021 | Bacterial growth medium |
| Monarch DNA gel extraction kit | NEB | T1020L | Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors |
| Monarch Plasmid Miniprep kit | NEB | T1010L | Miniprep kit ussed to purify plasmids |
| NanoDrop One | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration |
| NEBuilder Master Mix | NEB | E2621L | Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector |
| Q500 Sonicator | Qsonica | Q500-110 | Sonicator for virus lysates |
| RK13 cells | ATCC | CCL-37 | Rabbit kidney cells |
| VWR Multiwell Cell Culture plates | VWR | 10062-892 | Cell culture plates |
References
- Brochier, B., et al. Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine. Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).
- Pastoret, P. P., Brochier, B. The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur. Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).
- Chan, W. M., McFadden, G. Oncolytic Poxviruses. Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).
- Nguyen, D. H., et al. Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice. Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).
- Frentzen, A., et al. Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).
- Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. Poxviruses as vaccine vectors. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).
- COLLIER, L. H. The development of a stable smallpox vaccine. The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).
- Weir, J. P., Bajszár, G., Moss, B. Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).
- Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).
- Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).
- Falkner, F. G., Moss, B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).
- Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara. BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).
- Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. Construction and Isolation of Recombinant MVA. Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).
- Di Lullo, G., et al. Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).
- Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response. Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).
- Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A – G mismatch and noncontigous helixes. Biochimie. 37 (18), 6303-6316 (1998).
- Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation. Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).
- Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. Evolution of eIF2α kinases: Adapting translational control to diverse stresses. Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).
- Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. A survey of host range genes in poxvirus genomes. Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).
- Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).
- Romano, P. R., et al. Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain. Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).
- Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon. Virology. 183 (1), 419-422 (1991).
- Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus. Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).
- Rothenburg, S., Brennan, G. Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence. Trends in Microbiology. , (2019).
- Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression. BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).
- Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA). Biochimie. 86, 2172-2175 (1989).
- Chung, C. T., Miller, R. H. Preparation and storage of competent Escherichia coli cells. Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).
- Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication. PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465 (2013).
- Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells. Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).
- Ball, L. A. High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA. Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).
- Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells. Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).
- Liu, L., et al. Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus. BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).
